Funktionelle Charakterisierung der endothelvermittelten autoimmunen PAR-2 Aktivierung

Abstract

Background: Protease-activated receptor 2 (PAR-2) is a G protein-coupled receptor (GPCR) involved in angiogenesis. Autoantibodies targeting certain membrane receptors can influence angiogenesis and cancer development after transplantation. The presence of autoantibodies directed against PAR-2 (PAR-2+-IgG) in kidney transplant (KTx) patients and its angiogenic function have not been studied so far. Methods: IgGs were isolated from serum of healthy individuals and KTx patients by HiTrap Protein G columns and PAR-2 (PAR-2+-IgG) levels were confirmed by ELISA. PAR-2 signaling in response to natural activator trypsin, PAR-2 activating peptide (PAR-2 AP) and PAR-2+-IgG was studied in wild-type and PAR-2 overexpressing HMEC-1 by western blots and luciferase reporter assays. Real time PCR and ELISA were performed to study the effect of PAR-2 agonists and IgG on VEGFA production. The effect of PAR-2+-IgG on angiogenesis was studied using matrigel angiogenesis assay with endothelial cells. Results: PAR-2 levels from KTx patients (PAR-2--IgG) were lower than those from healthy controls (PAR-2+-IgG). Trypsin and PAR-2 AP activated Gα12/13, Gq11 and ERK1/2 signaling in PAR-2 overexpressing HMEC-1 cells in a dose-dependent manner. This resulted in increased promotor activity, mRNA and protein levels of VEGFA. PAR-2+-IgG activated Gα12/13, Gq11 and ERK significantly more strongly than PAR-2--IgG. PAR-2+-IgG increased VEGFA at both mRNA and protein level, which could be partially blocked by a PAR-2 specific blocker. Angiogenesis assay showed that PAR-2--IgG reduced vascular endothelial tube formation. Conclusion: The results here confirmed that PAR-2 couples with multiple G proteins, including Gα12/13 and Gq11, activates ERK, and leads to increased VEGFA in endothelial cells by the natural activator trypsin. PAR-2 autoantibodies present in healthy individuals activated same signaling cascades as trypsin and PAR-2 AP and were proangiogenic. In contrast, PAR-2--IgG from KTx patients were anti-angiogenic. The clinical relevance of this reduced in vitro angiogenesis of PAR-2--IgG from KTx patients has to be investigated in larger cohort studies in the future. It will be of interest whether these low PAR-2 antibody levels can be used as biomarkers, e.g. for cancer development, as demonstrated for PAR-1 autoantibodies.

Hintergrund: Protease-aktivierter Rezeptor 2 (PAR-2) ist ein G Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR), der bei Angiogenese eine wichtige Rolle spielt. Autoantikörper, die gegen bestimmte Membranrezeptoren gerichtet sind, können Angiogenese und auch die Entwicklung von Krebs nach Transplantation beeinflussen. Das Vorkommen von Autoantikörpern gegen PAR-2 bei Nierentransplantationspatienten (KTx) und deren potentiell proangiogene Funktion wurden bislang noch nicht untersucht. Methoden: Mittels HiTrap Protein G Säulen wurde IgG aus dem Serum von gesunden Kontrollpersonen und nierentransplanierten Patienten isoliert und PAR-2 Autoantikörpertiter durch ELISA bestimmt. In Wildtyp und PAR-2 überexprimierenden HMEC-1 wurden PAR-2 abhängige Signalwege nach Aktivierung durch Trypsin, PAR-2 aktivierendes Peptid (PAR-2 AP) und PAR-2+-IgG wurden mittels Westernblots und Luziferase Reporter Assays untersucht. Real time PCR und ELISA wurden verwendet, um die Effekte der PAR-2 Agonisten und IgG auf die VEGF Freisetzung zu bestimmen. Der Einfluss von PAR-2+-IgG auf die Angiogenese wurde durch Matrigel- Angiogeneseassays mit Endothelzellen analysiert. Ergebnisse: PAR-2 Autoantikörpertiter von nierentransplantierten (PAR-2--IgG) Patienten waren niedriger als in gesunden Kontrollen. In PAR-2 überexprimierenden HMEC-1 wurde durch Trypsin und PAR-2 AP der Gα12/13-, Gq11- und ERK1/2-Signalweg konzentrationsabhängig aktiviert. Dies führte zu einer erhöhten Promotoraktiviät, mRNA- und Proteinspiegel von VEGFA. PAR-2+-IgG aktivierte den Gα12/13-, Gq11- und ERK1/2-Signalweg signifikant stärker als PAR-2--IgG. PAR-2+-IgG erhöhte VEGFA sowohl auf mRNA, als auch auf Proteinebe, welches partiell durch PAR-2 spezifische Blocker gehemmt werden konnte. Angiogenesisassays zeigten, dass PAR-2--IgG zu einer verminderten endothelialen Netzwerkbildung führt. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass PAR-2 an mehrere G Proteine koppelt, darunter Gα12/13 und Gq11, den ERK-Signalweg aktiviert und zu erhöhtem VEGFA in Endothelzellen durch natürlichen Aktivator Trypsin führt. PAR-2 Autoantikörper von gesunden Personen aktivierten die gleichen Signalkaskaden wie Trypsin und PAR-2-AP und waren proangiogen. Dagegen wirkten PAR-2--IgG von KTx Patienten antiangiogen. Die klinische Bedeutung dieser verminderten in vitro Angiogenese von PAR-2--IgG von KTx Patienten sollte in zukünftigen größeren Kohortenstudien untersucht werden. Es wäre interessant, inwieweit niedrige PAR-2-Antikörperspiegel z.B. analog zu PAR-1 Autoantikörperspiegeln als Biomarker für ein erhöhtes Krebsrisiko eingesetzt werden könnten.