The focus of this study is ecdysterone, a steroid hormone naturally occurring in plants and invertebrates [19, 20]. Ecdysterone is contained in a wide range of dietary supplements available on internet, and there are many rumors on ecdysterone misuse by athletes. Ecdysterone is not yet included in the list of prohibited substances and methods in sports, even if previous studies reported growth promoting and anabolic effects of ecdysterone in various animal species and in humans [28-45], mediated by its interaction with ERbeta [29, 46, 47]. With the exception of few studies [32, 119, 120], the evaluation of the use of ecdysterone supplementation to improve performances and study on its metabolism, have not yet been extensively investigated in humans. As part of this project, an intervention study of strength training of 46 healthy males has been carried out. The evaluation of a long-term administration of an ecdysterone containing dietary supplement has been made, with a special focus on the enhance of the performance during resistance training. Different doses of a supplement labelled to contain 100 mg of ecdysterone per capsule were administered to volunteers for ten weeks. This study included two training groups, Ec1 and Ec2 , which took respectively two and eight capsules per day, one non-training COG, which took two capsules per day (similar to Ec1), and one PLG, which was training taking a supplement not containing any ecdysterone. This study considered and evaluated anthropometrical and performance parameters after ten weeks of administration of ecdysterone containing supplements, and as results, reports an increase in body weight, muscle mass and upper body strength performances. In addition, the in-vitro study performed, shows a hypertrophy in C2C12 myotubes after 48 hour of treatment with supplement extract. The liver and kidney toxicity of ecdysterone is excluded by evaluation of specific biomarker in serum; changes in the serum concentration of endocrine hormones IGF-1 and T4 are observed. Even if further investigations will be needed, also considering other endocrine hormones, it seems that ecdysterone can antagonize the decrease in IGF-1 levels and that intensive training may have an influence on T4. In serum samples, a dose dependent increase of ecdysterone is reported after a successful development and validation of an UHPLC-MS/MS method. After a complete anti-doping screening, no other prohibited substance has been detected in the post administration urines as well as in the supplements administered to volunteers, demonstrating that the obtained effects on performance are resulting from consumption of ecdysterone. Following evaluation of the steroidal profile, it is proved that ecdysterone cannot be detected by changes in parameters of the steroidal module. This suggests that the anabolic effect of ecdysterone is based on a different mechanism than other AAS. From the analysis of the supplement administered to volunteers results that only 6% of the labelled content of ecdysterone is present in the supplement and there is no presence of other performance enhancing substances. After a single dose administration of pure ecdysterone, its metabolism has been preliminary evaluated. Ecdysterone does not undergo phase II metabolism by conjugation with glucuronic or sulfuric acid. The 14-desoxy-metabolite is identified in post-administration urines through analysis with LC-QTOF-MS and confirmed by comparison with the MS/MS spectra of the synthetized 14-desoxy-ecdysterone. As result, ecdysterone (the most abundant analyte detected in post-administration urines) and the 14-desoxy-ecdysterone can be used for initial testing procedures for monitoring of ecdysterone administration in sport. Even more, excretion profiles of both ecdysterone and the 14-desoxy metabolite have been delineated. Finally, since the use of dietary supplements is increasing and their quality is not always guaranteed to consumers, due to the lack of adequate and uniform regulations, an UHPLC-MS/MS method for quantitation of 12 supplements labelled to contain ecdysterone has been developed and validated. The results report that in the 67% of the analyzed supplements, the labelled content of ecdysterone is highly inaccurate and, for some of them, the composition on the label is imprecise. Thanks to this project, the WADA has included ecdysterone in the 2020 Monitoring Program. Methods to trace back an administration of ecdysterone in urine and serum are made available together with a method for the unambiguous identification and quantitation of ecdysterone in natural preparations.
Der Fokus dieser Studie ist Ecdysteron, ein Steroidhormon, welches natürlich in Pflanzen und Wirbellosen vorkommt [19, 20]. Ecdysteron ist in vielen über das Internet erhältlichen Nahrungsergänzungsmitteln enthalten und es gibt viele Spekulationen über den Missbrauch von Ecdysteron bei Sportlern. Ecdysteron ist noch nicht in die Liste der verbotenen Substanzen und Methoden im Sport aufgenommen, selbst wenn frühere Studien Wachstumsförderung und anabole Effekte von Ecdysteron bei vielen Tierarten und beim Menschen nachweisen konnten [28-45]. Dies geschieht hauptsächlich über die Interaktion mit ERbeta [29, 46, 47]. Mit Ausnahme weniger Studien [32, 119, 120] ist der Einsatz von Ecdysteron-Supplementierung zur Leistungssteigerung und der Stoffwechsel beim Menschen noch nicht umfassend untersucht worden. Als Teil dieser Arbeit wurde eine Interventionsstudie zum Krafttraining mit 46 gesunden Männern durchgeführt. Es wurde der Langzeitgebrauch von einem ecdysteronhaltigen Nahrungsergänzungsmittel mit besonderem Fokus auf die Leistungssteigerung während des Krafttrainings untersucht. Unterschiedliche Dosen eines Nahrungsergänzungsmittels, welches laut Deklaration 100 mg Ecdysteron pro Kapsel enthalten sollte, wurden über einen Zeitraum von zehn Wochen von den Probanden eingenommen. Die Studie beinhaltete insgesamt vier Gruppen: zwei Trainingsgruppen, Ec1 und Ec2, nahmen jeweils zwei bzw. acht Kapseln pro Tag ein, eine nicht-trainierende COG, welche zwei Kapseln pro Tag einnahm (vergleichbar mit Gruppe Ec1) und eine PLG, welche bei Einnahme eines Nahrungsergänzungsmittels ohne Ecdysteron trainierte. Diese Studie betrachtete und beurteilte anthropometrische und Leistungsparameter nach zehn Wochen der Einnahme von ecdysteronhaltigen Nahrungsergänzungsmitteln und stellte als Ergebnis eine Zunahme des Körpergewichts, der Muskelmasse und der Oberkörperkraft fest. Darüber hinaus zeigt die durchgeführte in-vitro Studie eine Hypertrophie in C2C12 Myotuben nach 48 Stunden der Behandlung mit Nahrungsergänzungsmittel-Extrakt. Die Leber- und Nierentoxizität von Ecdysteron wird durch den Nachweis von spezifischen Biomarkern im Serum ausgeschlossen; Veränderungen in den Serumkonzentrationen der endokrinen Hormone IGF-1 und T-4 wurden beobachtet. Auch wenn noch weitere Untersuchungen unter Berücksichtigung anderer endokriner Hormone erforderlich sein sollten, kann festgestellt werden, dass Ecdysteron der IGF-1 Abnahme entgegenwirken kann und intensives Training einen Einfluss auf T4 haben kann. Nach erfolgreicher Entwicklung und Validierung einer UHPLC-MS/MS-Methode konnte eine dosisabhängige Zunahme von Ecdysteron in Serumproben nachgewiesen werden. Nach einem kompletten Anti-Doping Screening konnten weder in den postadministrativen Urinproben noch in den verabreichten Nahrungsergänzungsmitteln verbotene Substanzen nachgewiesen werden. Dies zeigt, dass die beobachteten Effekte der Leistungssteigerung von der Ecdysteroneinnahme herrühren. Nach Beurteilung des Steroidprofils konnte gezeigt werden, dass Ecdysteron nicht über Veränderungen von Parametern des Steroidmoduls nachgewiesen werden kann. Das deutet darauf hin, dass der anabole Effekt von Ecdysteron auf einem Mechanismus beruht, der von anderen AAS abweicht. Die Analyse der verabreichten Nahrungsergänzungsmittel zeigte, dass nur 6 % der deklarierten Menge an Ecdysteron tatsächlich in den Kapseln vorhanden war und dass keine weiteren leistungssteigernden Substanzen zugesetzt wurden. Der Metabolismus von Ecdysteron wurde nach einmaliger Applikation der Reinsubstanz vorläufig untersucht. Ecdysteron unterzieht sich keinem Phase II Metabolismus durch Konjugation mit Glucuron- oder Schwefelsäure. Der 14-Desoxy-Metabolit wurde in Postadministrationsurinen mittels Analyse an einem LC-QTOF-MS Instrument detektiert und durch den Vergleich mit dem MS/MS Spektrum dersynthetisierten Substanz bestätigt. Folglich können Ecdysteron, der am häufigsten inpostadministrativen Urinen detektierte Analyt und 14-Desoxy-Ecdysteron für ersteTestverfahren für die Überwachung des Ecdysterongebrauchs im Sport genutzt werden.Des Weiteren wurden Ausscheidungsprofile von Ecdysteron und 14-Desoxy-Ecdystreonerstellt. Da die Verwendung von Nahrungsergänzungsmitteln zunimmt und ihre Qualität denVerbrauchern mangels angemessener und einheitlicher Vorschriften nicht immer garantiertist, wurde schließlich eine UHPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von 12 mitEcdysteron markierten Nahrungsergänzungsmitteln entwickelt und validiert. Es wurdeherausgefunden, dass in 67 % der analysierten Nahrungsergänzungsmittel dergekennzeichnete Gehalt an Ecdysteron sehr ungenau ist und für einige von ihnen dieZusammensetzung unpräzise deklariert ist. Infolge dieser Arbeit hat die WADA Ecdysteronin das Monitoring Programm 2020 aufgenommen. Methoden zur Rückverfolgung einerEcdysteroneinnahme im Urin und im Serum wurden zusammen mit einer Methode zureindeutigen Identifikation und Quantifikation von Ecdysteron in natürlichen Zubereitungenbereitgestellt.
