Ein neuer Kreuzbandersatz - Tissue Engineering

Abstract

Der kraniale Kreuzbandriss des Hundes ist eines der häufigsten orthopädischen Erkrankungen und spielt dementsprechend in der modernen Tiermedizin eine wichtige ökonomische Rolle. In der Literatur sind über 120 unterschiedliche Therapieoptionen und -modifikationen beschrieben. Es wird zwischen intra- und extraartikulären sowie dynamischen Stabilisierungstechniken unterschieden. Während in der Humanmedizin der intraartikuläre Kreuzbandersatz der Goldstandard ist, ist es in der Veterinärmedizin zum aktuellen Zeitpunkt die TPLO – ein dynamisches Osteotomieverfahren. Das differenzierte Vorgehen liegt in der unterschiedlichen Ätiopathogenese und dem postoperativen Management sowie der unterschiedlichen Anatomie und Konfiguration des Kniegelenks bei Mensch und Hund begründet. Ziel ist eine Stabilisierung des Kniegelenkes zur Minimierung weiteren Verschleißes und zur Wiederherstellung der Funktionalität. In der Veterinärmedizin wurde bisher noch kein Transplantat gefunden, das in der Lage ist, das native Kreuzband zu ersetzten. Idealerweise muss es die identischen biomechanischen und physiofunktionellen Eigenschaften aufweisen und darf während des Einheilungsprozesses keiner Lockerung und Schwächung erfahren. Außerdem muss die immunologische Inertie gewährleistet sein. Fortschritte im Bereich des Tissue Engineering schaffen Möglichkeiten, die bisher existierenden Defizite auszugleichen und einen intraartikulären Ersatz des nativen Bandes zu optimieren. Beim Tissue Engineering werden Zellen, ein Trägergerüst und bioaktive Moleküle verwendet, um verletztes Gewebe zu reparieren oder ersetzen. Als Trägergerüst wurden equine und canine Sehnen verwendet, da sie ähnliche biomechanische und physiologische Eigenschaften wie das native Kreuzband aufweisen. Der strukturelle Aufbau unterscheidet sich nur geringfügig und die Immunogenität kann durch Entfernung zellulärer Bestandteile ausreichend reduziert werden. Dazu wurden die Sehnen über Nacht in destilliertem Wasser gewaschen und dann fünf Gefrier-Auftauzyklen (2 Minuten in flüssigem Stickstoff; 10-minütige Auftauphase im 37 °C warmen Wasserbad) durchgeführt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 1%igem Triton bzw. 1%igem TnBP über 24 Stunden. Der Zelldebris wurde durch Zugabe von DNase bei 37 °C über Nacht entfernt. Nach mehreren Waschvorgängen wurden die Sehnen bei - 80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Parallel wurden mesenchymale Stromazellen aus caninem Fettgewebe gewonnen und als ASCs charakterisiert. Dazu wurden die Zellen durch Zentrifugation, Kollagenaseverdau und Sieben aus dem Fettgewebe isoliert und anschließend kultiviert. Die ASCs der 3. und 4. Passage wurden durch Zugabe von Differenzierungsmedium in osteo-, adipo- und chondrogene Linie differenziert. Der Nachweis der Osteogenese erfolgte mikroskopisch durch Färbung der gebildeten Kalziumoxalate mit Alizarin Red und quantitativ mittels Absorptionsspektroskopie. Bei der Adipogenese wurden die Fettvakuolen mikroskopisch durch Färbung mit Oil Red O nachgewiesen. Die Chondrogenese wurde in zwei- und dreidimensionaler Kultur durchgeführt und der Nachweis erfolgte histologisch durch die Alician-Blau-Färbung der gebildeten Proteoglykane. Charakterisiert wurden die ASCs weiterhin durch den Nachweis spezieller Oberflächenmarker in der Durchflusszytometrie. Anschließend wurde eine Co-Kultivierung der ASCs mit den dezellularisierten Sehnen durchgeführt, um die Viabilität zu beurteilen. Zum Schluss fand die Rezellularisierung der Sehnen mit ASCs statt und das immogene und antiinflammatorische Potenzial wurde untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass beide verwendeten Protokolle (Triton X-100 und TnBP) zelluläre Bestandteile effektiv aus dem kompakten Sehnenmaterial entfernen, ohne die native Struktur wesentlich zu schädigen. Histologisch waren die dezellularisierten Sehnen frei von Zellen. Lediglich im Peritendineum ist vereinzelt Zelldebris nachweisbar. Die Sehnen wiesen einen deutlich reduzierten DNA-Gehalt im Vergleich zur nativen Sehne auf. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der Dezellularisierung mit Triton X-100 und TnBP nachgewiesen werden. Weiterhin hatten dezellularisierte Sehnen einen vergleichbaren Glykosaminoglykan- und Kollagengehalt wie native Sehnen. Bei Testung der Immunogenität konnten nach umfangreicher Optimierung der Dezellularisierung keine signifikanten Interleukin-Anstiege im Vergleich zur Negativkontrollgruppe festgestellt werden. Andererseits konnte gezeigt werden, dass der IL-1-Anstieg im Vergleich zur Positivkontrollgruppe signifikant reduziert war. Wenn die Dezellularisierungsgruppe in die beiden Protokolle aufgeteilt wurde, gab es kaum einen Unterschied zwischen Triton X-100 und TnBP. Aus caninem Fettgewebe konnten erfolgreich mesenchymale Stromazellen isoliert und passagiert werden. Die caninen ASCs zeigten Plastikadhärenz und positives Proliferationsverhalten. Sie konnten in osteogene, adipogene und chondrogene Linien differenziert werden und weisen charakteristische Oberflächenmarker auf. Sie sind CD29-, CD44-, CD90- und CD105-positiv und CD14-, CD45- und MHCII-negativ. Eine Co-Kultivierung von ASCs und dezellularisierten equinen und caninen Sehnen hatte keinen negativen Effekt auf die Viabilität der Zelle, sondern zeigte einen positiven Trend. Histologisch konnte nachgewiesen werde, dass sich equine und canine dezellularisierte Sehnen mit caninen ASCs rezellularisieren lassen. Positiv sticht die Tatsache heraus, dass die Zellen auch einen Zellmantel ähnlich des nativen Synoviums um die dezellularisierte Sehne formen. Die Immunogenität der rezellularisierten Sehnen lag deutlich unterhalb der Positivkontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass das gewählte Modell für die Herstellung eines neuen Kreuzersatzbandes vielversprechende Ergebnisse liefert. Eine Optimierung der homogeneren Verteilung und besseren Ausrichtung der Zellen könnte mithilfe der Verwendung eines Bioreaktors erfolgen. Da die Sehnen jedoch wenige Tage nach der Rezellularisierung ins Tier eingebracht werden sollen und somit in einen natürlichen Bioreaktor eingepflanzt werden, besteht keine zwangsläufige Notwendigkeit. Dafür sind weitere Untersuchungen notwendig.

Cranial cruciate ligament tears are among the most common orthopedic disorders in dogs and they play a significant economic role in veterinary medicine. More than 120 different therapeutic options and modifications have been described in the literature, including intraand extra-articular as well as dynamic stabilizing techniques. While intra-articular cruciate ligament repairs are currently the accepted standard in human medicine, the TPLO, a dynamic osteotomy-technique, is most commonly recommended in veterinary medicine. This discrepancy is based on differences in etiopathogenesis and post-operative care as well as on the distinct anatomy and configuration of the knee joint in humans and of the stifle joint in dogs. The objective in both species is to stabilize the joint, thereby minimizing further degeneration and restoring function. So far, in veterinary medicine no transplant material has been found that can replace native cruciate ligaments. Ideally, it should possess identical biomechanical and physiologically functional properties and should not loosen or weaken during graft integration. Such transplants must also be immunologically inert. Advances in tissue engineering offer possibilities to level existing discrepancies and to optimize intra-articular replacement of the native ligament. Tissue engineering involves using cells, a scaffold and bioactive molecules for the purpose of repairing or replacing injured tissues. In this study, equine and canine tendons were used as scaffolds because they possess biomechanical and physiological properties similar to those of the native cruciate ligament. They differ only slightly in terms of their structural composition and their immunogenicity can be reduced sufficiently by removing cellular components. For this purpose, the tendons were washed in distilled water for 12 hours, after which five freezing and thawing cycles (two minutes in liquid nitrogen; a 10-minute thawing phase in a 37°C water bath) were performed. Subsequently, 1% Triton X-100 or 1% TnBP were added for the duration of 24 hours. Cell debris was then removed over night by adding DNase at 37°C. After several washing cycles the tendons were stored at -80°C prior to further processing. Meanwhile, mesenchymal stromal cells (ASCs) were obtained from canine adipose tissue and isolated by a process of centrifugation, collagenase digestion and straining, followed by cultivation. Third and fourth passage ASCs were differentiated into osteo-, adipo- and chondrogenic lines. Identification of osteogenesis was performed microscopically by staining newly formed calcium oxalates with Alizarin Red as well as quantitatively through absorption spectroscopy. Adipogenesis was identified microscopically by staining the lipid vacuoles with Oli Red O. Chondrogenesis was performed in two- and three-dimensional cell cultures and it was identified histologically after staining newly formed proteoglycans with Alcian Blue. The ASCs were characterized by flow-cytometric detection of specific cell surface markers. Subsequently, the ASCs were co-cultivated with the decellularized tendons so that their viability could be assessed. Finally, the tendons were recellularized and their immunogenic and anti-inflammatory potential was examined. The results suggest that both protocols used here (Triton X-100 und TnBP) allow for the effective removal of cellular components from compact tendon material without permanently damaging their native structure. Histologically, the decellularized tendons were free from cells. Only the peritendineum contained barely detectible amounts of cell debris. The tendons contained significantly reduced DNA as compared to native tendons. No significant difference was found between decellularization with Triton X-100 and TnBP. Additionally, decellularized tendons possessed similar levels of glycosaminoglycans and collagen to those in native tendons. In testing for immunogenicity, no evidence of a significant increase in interleukins was found after optimization of the decellularization protocol when compared to the negative control. However, the IL-1 increase was significantly lower as compared to the positive control group. Splitting the decellularization groups by protocol yielded no measurable difference between Triton X-100 and TnBP. Mesenchymal stromal cells were successfully isolated from canine adipose tissue. Canine ASCs showed plastic adherence and positive proliferation properties. They were able to be differentiated into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lines and were shown to possess characteristic surface markers. They are CD29, CD44, CD90 and CD105 positive and CD14, CD45 and MHCII negative. Co-cultivation of ASCs and decellularized equine and canine tendons had no negative effect on the viability of the cell, in fact, it showed a positive trend. Histological evidence showed that decellularized equine and canine tendons can be recellularized with canine ASCs. A particularly encouraging finding was that the cells produced a membrane around the decellularized tendon, similar to that of the native synovium. The immunogenicity of the recellularized tendons was significantly lower as compared to the positive control. The results suggest that the chosen model for developing a new cruciate ligament replacement is quite promising. An optimization of homogenous distribution and better alignment of the cells may be achieved by using a bioreactor. However, the tendons must be inserted into the animal shortly after recellularization and are therefore already grafted into a natural bioreactor. Therefore, it is debatable whether such a measure is useful and thus requires further studies.