Das proteolytische Spaltprodukt E3-Fragment am C-terminalen Ende der Laminin-1 a1-Kette repräsentiert die beiden tandemartig angeordneten LG4-und LG5-Module. Im Rahmen dieser Arbeit wurden für das E3-Fragment und seine einzelnen Module sechs verschiedene Konstrukte hergestellt, um die Grenzen selbsständiger Faltungseinheiten und insbesondere die Zugehörigkeit der einzelnen Cysteine festzulegen. Die Transfektion dieser sechs Konstrukte in 293 bzw. 293-EBNA Zellen führte nicht in allen Fällen zur Expression der rekombinanten Fragmente, obwohl Northern-Blot-Analysen bestätigten, daß alle transfizierten Zellen Laminin-spezifische mRNAs der erwarteten Größe produzierten. Die Daten bestätigten, daß für die korrekte Faltung des rekombinanten a1LG4-5 Fragments (entspricht dem nativen E3-Fragment), sieben Cysteine benötigt werden, wobei man a1LG4 drei und a1LG5 vier zuordnen konnte. Die Reinigung der rekombinanten Proteine mit den korrekten Modulgrenzen gelang in chromatographischen Schritten, und führte in allen Fällen zu reinen Proteinfraktionen, die gelelektrophoretisch homogene Banden aufwiesen. Die N-terminale Sequenzierung der rekombinanten Fragmente bestätigte den korrekten Übergang zur erwarteten Laminin-Sequenz. Die native Faltung wurde durch Elektronenmikroskopie, CD- Spektroskopie, Proteaseresistenz und immunologische Nachweise unter Verwendung verschiedener Antikörper, die bestimmte konformationelle Bindungsepitope erkennen, bestätigt. Die Immunisierung eines Kaninchens mit dem rekombinanten a1LG4-Fragment lieferte ein polyklonales Antiserum mit dem ein spezifischer und sensitiver Radioimmunassay entwickelt wurde. Bindungsanalysen der rekombinanten Proteine mit Heparin, Sulfatiden und a-Dystroglycan konnten den Bindungsbereich auf das a1LG4-Fragment eingrenzen.
The 395-residue proteolytic fragment E3, which comprises the two most C-terminal LG modules of the mouse laminin a1 chain, was previously shown to contain major binding sites for heparin, a-dystroglycan and sulfatides. The same fragment (a1LG4-5) and its individual a1LG4 and a1LG5 modules have now been obtained by recombinant production in mammalian cells. These fragments were apparently folded into a native form, as shown by circular dichroism, electron microscopy and immunological assays. Fragment a1LG4-5 bound about five- to tenfold better to heparin, a-dystroglycan and sulfatides than E3. These binding activities could be exclusively localized to the a1LG4 module. Side-chain modifications and proteolysis demonstrated that lysine and arginine residues in the C-terminal region of a1LG4 are essential for heparin binding. This was confirmed by 14 single to triple point mutations, which identified three non-contiguous basic regions (positons 101, 103, 105, 126-128, 154, 155) as contributing to both heparin and sulfatide binding. Two of these regions were also recognized by monoclonal antibodies which have previously been shown to inhibit heparin binding. The same three regions and a few additional basic residues also make major contributions to the binding of the cellular receptor a-dystroglycan, indicating a larger binding epitope. The data are also consistent with previous findings that heparin competes for a-dystroglycan binding.
