Einleitung: Die Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) zählt mit einer Letalität von bis zu 60% zu den schwersten Komplikationen der hämatopoetischen Stammzelltransplantation. Bisher sind Diagnose und Therapie erst nach dem Auftreten klinischer Symptome möglich. Um eine GvHD jedoch möglichst im Vorhinein zu verhindern, wird als Goldstandard die MHC-Expression von Spender und Empfänger vor der Transplantation verglichen, wobei eine hohe genetische Übereinstimmung mit einer geringeren GvHD-Inzidenz korreliert. Dennoch kann es sogar bei nahezu identischen MHCs zu einer GvHD kommen. Analog zum prätransplanten, donor-spezifischen IFN-γ-Elispot-Assay, der in der Nierentransplantation verwendet wird, wird in dieser Arbeit versucht ein Verfahren zu etablieren, das eine Abschätzung des GvHD- und des Abstoßungsrisikos vor Transplantation zusätzlich zur MHC-Expression ermöglicht.
Methodik: Um das Verfahren zu etablieren, wurde peripheres Blut von 20 gesunden Spendern in einer two-way mixed lymphocyte reaction co-kultiviert und die Aktivierung der T-Zellen nach 17 Stunden Stimulationszeit mittels Durchflusszytometrie (FACS) gemessen. Für die letzten 2 Stunden (Ansatz 1) bzw. 13 Stunden (Ansatz 2) der Gesamtstimulationszeit wurde Brefeldin A hinzugegeben. Als Aktivierungsmarker wurden CD137, CD154, Granzym B, TNF-alpha, IFN-γ und IL-2 verwendet. Die Marker und der Zeitpunkt mit der höchsten Induktion und dem niedrigsten Background wurden bestimmt. Anschließend wurden diese in vier Patientenproben und deren Spendern gemessen. Alle Patienten wurden aufgrund einer Sichelzellkrankheit transplantiert. In einem zweiten Schritt wurde mittels FACS analysiert, ob die Aktivierung aus einer neu-induzierten (de novo = naive) oder einer Gedächtniszell-vermittelten Immunantwort bestand.
Ergebnisse: Bei der Verfahrensetablierung konnte in allen nicht-MHC-identen Gesunden eine T-Zell-vermittelte Erkennung von fremd-MHC gemessen werden. Die Marker mit der stärksten Induktion waren die Kombination aus CD137 und CD154, CD137 und IL-2 auf CD4+ T-Zellen sowie CD137 und Granzym B auf CD8+ T-Zellen. Die für eine Alloreaktion verantwortlichen T-Zellen waren vor allem Central-Memory-Zellen (TCM) und RA-positive T-Effektor-Memory-Zellen (TEMRA).
Introduction: Graft-versus-host disease (GvHD) is with up to 60% lethality a major complication after hematopoietic stem cell transplantation that up to now can only be diagnosed and treated after onset of clinical symptoms. To prevent GvHD, MHC expression of donor and recipient is matched before transplantation. A high match correlates with a low manifestation of GvHD. GvHD can still occur in a highly-matched donor recipient pair. In analogy to the so called pretransplant donor-specific IFN-γ-Elispot-assay in kidney transplantation this paper’s goal is to establish an assay to evaluate risk for GvHD-development and rejection after hematopoietic stem cell transplantation.
Methods: To establish the assay peripheral blood from 20 healthy donors was co-cultured comparable to a two-way mixed lymphocyte reaction and activation of T cells after 17 hours stimulation time was measured via flow cytometry (FACS). For the last 2 hours (reaction mixture 1) or the last 13 hours (reaction mixture 2) of stimulation time Brefeldin A was added. As primary outcome, the expression of activation markers (CD137, CD154, Granzyme B, TNF-alpha, IFN-γ und IL-2) was analysed and quantified. Activation markers and time points after Brefeldin A addition were compared and markers (marker combinations and time points) with the highest induction and lowest background were selected. These chosen markers were used for patients and their donor samples. All patients (included) were transplanted for their underlying Sickle Cell Disease. In an additional step the activation marker expressing T cells were analysed via FACS-analysis and assigned to their T memory subset affiliation.
Results: During establishment, all healthy donors showed a T cell mediated alloreaction against their non-matched reaction partner. The activation markers with the highest induction were a combination of CD137 and CD154, CD137 and IL-2 on CD4+ T cells as well as CD137 and Granzyme B on CD8+ T cells. Responsible T cells for the alloreaction were mainly central memory T cells (TCM) and T effector memory RA positive T cells (TEMRA).
Conclusion: A T cell allo-assay was successfully established. Nevertheless, further clinical immune monitoring is necessary to evaluate the power of the assay’s predicational capacity.
