Funktionelle Analysen von Transkriptionsfaktoren mit einer Rolle in der chondrogenen und osteogenen Differenzierung mittels ChIP-seq

Abstract

Die Chromatin-Immunpräzipitation mit nachfolgender Sequenzierung der gefällten Fragmente mittels Next-Generation Sequencing-Technologien (ChIP-seq) hat sich in den letzten Jahren zu einem wichtigen Werkzeug entwickelt, um genomweite in vivo DNA-Interaktionen von Transkriptionsfaktoren zu detektieren. Zum einen können Zielgene eines Transkriptionsfaktors identifiziert werden, zum anderen aber auch vergleichende Untersuchungen der DNA-Bindung durch verschiedene Transkriptionsfaktoren untersucht werden. Die Durchführung und Auswertung von ChIP-seq-Experimenten unterliegen jedoch immer noch einigen Begrenzungen, wie die Verfügbarkeit ausreichend spezifischer und affiner Antikörper für den gewünschten Transkriptionsfaktor, und die Auswertung und weitere Analyse tausender potentieller Bindestellen. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Modellsystem erarbeitet, um die Vorteile von ChIP-seq-Analysen effizient zu nutzen. In Hühner-Micromasskulturen wurden drei jeweils mit einem FLAG-Epitop versehenen Transkriptionsfaktoren exprimiert und deren Bindungsstellen identifiziert. Hierfür wurden die Transkriptionsfaktoren RUNX2, MSX2 und TWIST2 gewählt, die alle drei eine essentielle Rolle in der Skelettentwicklung haben und Teil des gleichen genregulativen Netzwerkes sind. Dabei konnte das potentielle RUNX2-Zielgen CADHERIN2 bestätigt werden. Außerdem konnte der Notch-Signalweg als möglicher Schnittpunkt der Msx2- und Runx2-Regulationsnetzwerke identifiziert werden, der vermutlich über die Regulation von Notch2 und Hey1 gesteuert wird. Es konnte zudem gezeigt werden, dass Hühner-Micromasskulturen ein gutes Modellsystem darstellen, das trotz Überexpression von Faktoren die Identifizierung und Untersuchung relevanter Zielgene ermöglicht und damit ein sehr geeignetes System für Primäranalysen mittels ChIP-seq darstellt. Weiterhin konnten die Interaktion von MSX2 und RUNX2 sowie die primär Kofaktor-abhängige DNA-Bindung von MSX2 auf genomweiter Ebene bestätigt werden. Daher wurde zudem eine Möglichkeit erarbeitet, die MSX2-DNA-Interaktion über Kofaktoren weiterführend mittels ChIP-seq zu untersuchen. Durch ChIP-seq-Analysen von MSX2 und drei humangenetisch relevanten Mutationen in der Msx2-Homöodomäne konnten neue Einblicke auf die Eigenschaften der Mutationen gewonnen werden. So deuten die Ergebnisse der Analyse der Mutation MSX2P7H auf eine veränderte Affinität zu potentiellen Kofaktoren hin. Dieses Ergebnis, sowie die Untersuchung der Twist2S146P- Mutation in der Runx-interagierenden Twistbox zeigten, dass ChIP-seq nicht nur die Möglichkeit bietet, die direkte DNA-Interaktion zu untersuchen, sondern auch Aufschlüsse über Kofaktor-Interaktionen zu geben. Es konnte somit gezeigt werden, dass die Methode der ChIP-seq einen umfassenden Einblick in die in vivo Eigenschaften von Transkriptionsfaktoren und die Effekte von Transkriptionsfaktormutationen bietet.

Chromatin immunoprecipitation followed by next-generation-sequencing (ChIP- seq) of precipitated fragments has become an important tool to study transcription factor-DNA-interactions in a genome wide scale and in vivo. It is utilized mainly to identifiy target genes of individual transcription factors, but also to compare the binding patterns of several related transcriptions factors. However, performing and evaluating ChIP-seq experiments is challenging for multiple reasons. Antibody availability and specificity is still a major limitation leading to low enrichment of transcription factor-bound DNA or crossreactivity with other proteins than the targeted transcription factor. To utilize the advantages of ChIP-seq for the investigation of the gene regulatory network of chondrogenic and osteogenic differentiation, a model system has been set up in a biological relevant cell culture system: ChIP-seq was performed in chicken micromass cultures overexpressing FLAG-tagged versions of the transcription factors RUNX2, MSX2 and TWIST2. All three of them are part of the same gene regulatory network. Using ChIP-seq, the potential RUNX2 target gene CADHERIN2 could be verified. Furthermore the Notch signaling pathway was identified as a potential point of intersection of Msx2 and Runx2 function in skeletal differentiation, presumably by regulating both Notch2 and Hey1 proteins. This also proved the chicken micromass culture as well-suited model system for identifying biological relevant target genes as well as performing functional assays with identified genes. It can be therefore used efficiently to implement primary ChIP-seq analysis. ChIP-seq experiments validated the protein-protein interaction of MSX2 and RUNX2 in a genome wide scale and found clear indications of cofactor-dependent DNA-binding of MSX2. Moreover, a method has been established to further study the MSX2-DNA-interaction via cofactors using ChIP-seq in micromass cultures that coexpress both MSX2 and RUNX2 and that now can be used together with further potential cofactors of MSX2. Analyzing ChIP- seq results of MSX2 and three disease-causing missense mutations in the Msx2-homeodomain brought new insights into the binding characteristics of these mutations: Motif analysis of MSX2P7H bound sequences points towards altered affinity in cofactor-dependent DNA-binding. Similar results were found for the TWIST2 variant TWIST2S146P, which carries a missense mutation in the Runx2-interacting twistbox. Both findings demonstrate that ChIP-seq can also deliver insights into cofactor-dependent DNA-interactions of the ChIP-ed transcription factor. In conclusion, the ChIP-seq approach applied here cleary illustrates that ChIP-seq can be used to gain insights into the in vivo characteristics of transcription factor DNA-binding and consequences of transcription factor mutations.