BMP-modulated extracellular matrix mechanics in the early phase of fracture healing

Abstract

Regenerative medicine aims to re-establish full functionality of tissues and organs after injury through the stimulation of the body’s endogenous repair mechanisms. In higher mammals, bone is one of the few tissues that shows a natural self-healing capacity and therefore can be used as a model system to describe regenerative processes. A detailed understanding eventually can be translated to other tissues and organs with an intrinsically poor healing outcome such as tendon, cartilage, cardiac and skeletal muscle. But even for bone the natural regenerative capacity can be exceeded, especially when large quantities of tissue need to be restored. Approximately 10% of all fractures result in a delayed healing or even a non-union which requires clinical intervention and follow-up. Bone morphogenetic proteins (BMPs) are potent osteoinductive growth factors with clinical approval for usage in open tibial fractures and spinal fusions. Despite its beneficial effect on the overall healing outcome, the supra-physiological amounts lead to various side effects. While it is generally believed that BMPs mostly affect cell migration and differentiation, only limited information is available how early extracellular matrix formation and patterning is influenced. This thesis investigated the process of tissue formation in vitro using a soft macroporous collagen scaffold and how BMP stimulation affected this process. Tissue formation and tensioning was found to strongly depend on the presence of collagen fibers. It could be demonstrated that tissue forming cells incrementally transfer and store cellular forces inside a tensioned fibrillar collagen network which led to a multiplication of macroscopic tension. Stimulation with BMP during the process of tissue formation led to an acceleration of contraction and an increased stiffening which was followed by a matrix metalloproteinase- mediated remodeling and softening. Collagen scaffolds of varying stiffness were finally used as a model system to investigate the influence of an altered mechanical environment on BMP signaling. Cells showed an increased BMP responsiveness when cultured inside very soft collagen scaffolds (0.5kPa) compared to stiffer environments (>4kPa). Intriguingly, cellular migration within soft scaffolds led to a systemic deformation of the underlying biomaterial which might be responsible for an inter-cell communication through substrate deformation. II Abstract Taken together, this thesis provided insights into formerly unknown aspects of tissue formation as well as how BMP stimulation modulates and signaling response itself becomes modulated by this process. These findings are expected to contribute to future biomaterial design in order to overcome limitations of current treatment options for bone defects as well as to increase safety and efficacy of BMPs in clinical applications.

Regenerative Medizin verfolgt die Wiederherstellung der vollen Funktionalität von Geweben und Organen nach Verletzung durch die Aktivierung körpereigener Reparaturmechanismen. In höheren Säugetieren weist Knochen als eines der wenigen Gewebe des Körpers eine natürliche Fähigkeit zur Selbstheilung auf und kann damit als Modellsystem für regenerative Prozesse genutzt werden. Ein tiefgreifendes Verständnis dieser ließe sich eventuell auf andere Gewebetypen, wie z.B. Sehnen, Knorpel, Skelett- und Herzmuskel, übertragen, welche über eine verringerte Fähigkeit zur Selbstheilung verfügen. Jedoch kann in manchen Fällen selbst im Knochen die natürliche Fähigkeit zur Heilung unzureichend sein, besonders, wenn größere Mengen an Gewebe wiederhergestellt werden müssen. So tritt in etwa bei 10% aller Knochenbrüche eine verzögerte oder sogar eine Nicht-Heilung auf, welche klinische Behandlung erfordert. Bone morphogenetic proteins (BMPs) sind Wachstumsfaktoren mit einem hohen osteoinduktiven Potential und sind zur klinischen Behandlung offener Tibia-Frakturen sowie Wirbelkörperfusionen zugelassen. Obwohl eine Behandlung mit BMPs den generellen Heilungsverlauf verbessert, sorgen die hohen Mengen die eingesetzt werden oft für Nebenwirkungen. Während allgemein angenommen wird, dass BMPs hauptsächlich durch die gerichtete Einwanderung und Differenzierung von Stammzellen wirken, ist nur wenig darüber bekannt inwieweit frühe Gewebeformationsprozesse beeinflusst werden. Diese Arbeit befasste sich mit dem Prozess der Gewebeformation in vitro mittels eines makroporösen Kollagen Biomaterials sowie dem Einfluss von BMP Stimulation auf diese Prozesse. Es konnte gezeigt werden, dass Gewebeformation und Vorspannung stark von der Anwesenheit von Kollagenfasern abhängig waren. Dies bedeutet, dass gewebebildende Zellen schrittweise Kraft in vorgespannte Kollagenfasern übertragen und speichern was zu einer Vervielfachung der makroskopischen Gewebespannung führt. BMP Stimulation beschleunigte diesen Prozess, was zu einer erhöhten Gewebeversteifung führte, die jedoch durch einen Metalloproteinase-vermittelten Umbauprozess reduziert wurde. Biomaterialen mit unterschiedlicher Steifigkeit wurden zu guter Letzt als Modellsystem verwendet um den Einfluss einer veränderten mechanischen Umgebung auf die BMP Signalgebung zu untersuchen. Zellen wiesen eine erhöhte BMP-Antwort auf wenn sie in einem weichen Biomaterial kultiviert wurden (0.5kPa) verglichen mit steiferen IV Zusammenfassung Umgebungen (>4kPa). Es zeigte sich, dass zelluläre Bewegungen in einer weichen Umgebung zu einer systemischen Verformung des zugrundeliegenden Materials führt, was auf eine Möglichkeit zellulärer mechanischer Kommunikation mittels Substratverformung hindeutet. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit bisher unbekannte Aspekte der Gewebeformation auf, sowie der Einfluss von BMP Stimulation auf diese Prozesse. Diese neuartigen Erkenntnisse unterstützen potentiell die Entwicklung zukünftiger Biomaterialien um sowohl die Limitationen gegenwärtiger Behandlungsoptionen bei der Behandlung großer Knochendefekte zu überwinden, als auch Sicherheit und Effizienz von BMPs in klinischen Anwendungen zu verbessern.