In recent years, upconversion nanoparticles (UCNP) have emerged as potential inorganic NIR-fluorescence bioimaging agents. Upconversion (UC) is a non-linear optical process, where the sequential excitation of two or more lower energy photons results in the emission of photons with higher energy. Long-live emission lifetimes, defined emission peaks, high photostability, and high biocompatibility are among the advantages of UCNP. However, these particles suffer from quenching caused by crystal defects, and they have a low quantum yield. One possibility to tune and enhance the luminescence is to couple the UCNP with plasmonic metal shells such as gold or silver. The core-shell size ratio of these metal-shell particles can be tuned in such ways, so that their surface plasmon resonance varies over a wide wavelength range. A dielectric spacer such as silica between the metal shell and the UCNP can prevent direct contact between lanthanide ions and the metal shell to prevent quenching without hindering excitation or emission of light, a process also used to study the distance dependency of plasmon-modified upconversion. Predictions of the suitable UCNP core-silica spacer-gold shell system through theoretical calculations and simulations were provided. Afterward, nanoparticles with an appropriate size and spacer/shell thickness were synthesized, based on the calculated structures where the highest emission UC luminescence enhancement could be achieved. Through a thermal decomposition method with oleate precursors, monodisperse NaYF4 host crystals with Yb3+ ions as sensitizer and Er3+ ions as emitter core with size less than 50 nm diameter were synthesized, followed by a stepwise controlled growth of the silica spacer through a combination of the reverse microemulsion and Stöber method to bring the core to a suitable size. Finally the silica-coated UCNP core was coated with a gold shell. The thickness of the synthesized silica shells could be controlled between 7-149 nm on 24±2 nm diameter NaYF4: Yb, Er host structures. The gold shell thickness could be varied between 30 and 68 nm, depending on the proper core-gold shell ratio for the plasmon enhancement experiments. Fluorescence decay lifetimes and the UC fluorescence intensities were obtained via single particle measurements in a confocal setup to determine the changes of the UC-luminescence emission based on variations of the gold shell thickness. In the single particle measurements, the emission intensity at 540 nm (green) and 654 nm (red) emission after gold shell coating decreased. Furthermore, an increase in the decay time was also observed, indicating a quenching occurrence. The quenching indicated an increase of the non-radiative decay rate for both emission wavelengths, due to absorption of upconversion emission energy from excited Er3+ ions by the gold shell or by an energy transfer of the emission to the gold shell. A thermal quenching effect, indicated by an increase of the lifetime at different excitation energies, could be caused by high excitation power densities in the single particle measurements. A thick gold shell of 48 nm on 24 nm UCNP core with 149 nm silica shell caused stronger cavity confinement, where the thick shell obstructed the excitation photons from reaching the UCNP, thereby preventing the emitted photons from being detected. Another UCNP application of interest in bioimaging or bioassays lies in their coupling to organic dyes. As UCNP generally have a low quantum yield, and as their use is limited in bioimaging applications, they can be coupled with organic chromophores, which can receive the upconversion emission energy through a fluorescence resonance energy transfer (FRET) process and fluoresce. Activation of contrast agents through NIR light has advantages regarding high tissue penetration and almost no auto-fluorescence compared to the activation with UV light that has photodamaging characteristics and induces background fluorescence. For this purpose, a commonly used organic dye, Rhodamine B isothiocyanate (RBITC) was coupled in various concentrations in silica shells coated on UCNP cores. After excitation of the UCNP core with NIR light and a non-radiative energy transfer from UCNP emission to the dye, emission of RBITC occurred in the 580 nm range. Further characterization of the UC fluorescence emission indicated that a slight energy transfer of the green (540 nm) emission occurred from UCNP to the RBITC dye. However, according to measurements of the decay lifetimes, the emission of the dye was mainly due to the reabsorption effect from the UC emission. The small number of erbium ions on the surface transferred their energy through the FRET process to the rhodamine dye, while the reabsorption occurred between the majority of the erbium ions inside the UCNP sphere and the dye molecules in the silica. Next, the cytotoxicity of silica coated UCNP on human keratinocytes (HaCaT cells) and murine macrophages (RAW 264.7 cells) was investigated with an 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Microporous silica shells with various thicknesses were coated onto the UCNP NaYF4:Yb, Er (d = 33±2 nm) to increase the hydrophilicity of the particles and enabled them to be dispersed in cell culture medium for biological experiments. Part of the samples was subsequently functionalized with N-(6-Aminohexyl)aminopropyltrimethoxysilane (AHAPS) that provided a positive charge on the NP surface to increase their uptake rate into cells. Generally, the non-functionalized particles show a lower degree of cytotoxicity to HaCaT than the amino-functionalized particles, due to a higher uptake of the positively functionalized particles resulting from a higher degree of initial interactions with the negatively charged cell membranes. The thickness of the silica shells did not heavily influence the cytotoxicity of the HaCaT cells. In the flow cytometry measurements, the cells’ granularity was quantitatively measured after exposure to the particles. The samples with functionalized particles caused higher changes in cell granularity compared to the non-functionalized particles, and this could be correlated to the higher cytotoxicity of amino-functionalized particles. In the murine macrophage RAW 264.7 cells, the thickness of the silica played a significant role in the degree of cytotoxicity, whereby the particles with the 7 nm silica shell were generally more cytotoxic than those with a 21 nm thick shell, due to a higher degree of lanthanide ion release. In the ion release experiments using Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) measurements, it was shown that more lanthanide ions were released from thinner coated samples, which influences the degree of cytotoxicity of the particular samples. It could be shown that reductions in cell viability and an increase of macrophage granularity occurred after exposure, depending on the silica shell thickness of the particles.
In den letzten Jahren haben Upconversion-Nanopartikel (UCNP) als potenzielle anorganische NIR-Fluorophore für biologische Bildgebungsverfahren Bedeutung erlangt. Die Upconversion (UC) oder Aufwärtskonvertierung ist ein nicht-linearer optischer Prozess, bei dem die sequenzielle Anregung von zwei oder mehr Photonen mit niedrigerer Energie zu einer Emission mit höherer Energie führt. Langlebige Emissionslebensdauer, definierte Emissionswellenlängen, hohe Photostabilität und hohe Biokompatibilität gehören zu den Vorteilen von UCNP. Diese Partikel neigen jedoch zu Fluoreszenzlöschung durch Kristallstrukturdefekte und haben folglich eine geringe Quantenausbeute. Eine Möglichkeit, um ihre Lumineszenz zu verstärken, besteht in der Kopplung der UCNP mit plasmonischen Metallschalen aus Gold oder Silber. Diese Metallschalenpartikel können durch Änderung des Kern-Schale-Verhältnisses so eingestellt werden, dass ihre Oberflächenplasmonenresonanz über einen großen Wellenlängenbereich variiert. Ein dielektrischer Abstandshalter wie eine Silicaschale zwischen der Metallhülle und dem UCNP kann einen direkten Kontakt zwischen den Lanthanoid-Ionen und der Metallhülle verhindern und so eine Auslöschung der Emission vermeiden, ohne dass Anregungs- oder Emissionslicht abzuschirmen, was auch zur Untersuchung der Abstandsabhängigkeit der plasmon-modifizierten UC-Emission verwendet wird. Es wurden erst theoretische Berechnungen und Simulationen zur Ermittlung geeigneter UCNP-Kern-Silica-Abstandhalter-Gold-Schale-Größenverhältnisse für optimale Emissionsverstärkung durchgeführt. Anschließend wurden Nanopartikel mit entsprechender Größe und passendem Kern-Schale-Abstand synthetisiert, basierend auf den berechneten Strukturen, bei denen die höchste UC-Lumineszenzverstärkung erwartet wurde. Durch ein thermisches Zersetzungsverfahren von Oleat-Präkursoren wurden monodisperse NaYF4-Wirtskristalle mit Yb3+-Ionen als Sensibilisator und Er3+-Ionen als Emitter mit einer Größe von weniger als 50 nm Durchmesser synthetisiert. Hieran schloss sich ein schrittweises, kontrolliertes Wachstum der Silicaschicht durch Kombination eines modifizierten Mikroemulsionsverfahrens mit der Stöber-Methode an. Schließlich wurden die Silica-beschichteten UCNP-Kerne mit einer Goldschale beschichtet. Die Dicke der Silicaschale wurde zwischen 7-149 nm auf UCNP mit einem Durchmesser von 24±2 nm eingestellt, und die Dicke der Goldschale konnte zwischen 30 und 68 nm variiert werden. Das Kern-Schale-Verhältnis wurde entsprechend der obengenannten Rechnungen angepasst. Die Fluoreszenz-Lebensdauer und die Intensität der UC-Fluoreszenz wurden durch Einzelpartikelmessungen in einem konfokalen Aufbau ermittelt, um den Einfluss der Variation der Goldschalendicke zu bestimmen. Bei den Einzelpartikelmessungen nahm die Intensität bei der Emission bei 540 nm- (grün) und 654 nm- (rot) nach dem Beschichten mit einer Goldschale ab und die Fluoreszenzabklingzeit nahm zu, was auf Fluoreszenzlöschung hindeutet. Diese Löschung könnte durch eine Erhöhung des nicht-strahlenden Abklingens der angeregten Photonen verursacht werden, in Folge der Absorption der UC-Emission der angeregten Er3+-Ionen durch die Goldschale oder durch eine Energieübertragung der Emission auf die Goldschale. Ein thermischer Löscheffekt, der durch eine Erhöhung der Lebensdauer bei unterschiedlichen Leistungsdichten angedeutet wurde, sollte zudem bei hohen Anregungsleistungsdichten bei den Einzelpartikelmessungen in Betracht gezogen werden. Eine 48 nm dicke Goldschale auf einem 24 nm großen UCNP-Kern mit einer 149 nm dicken Silicaschale bewirkte einen stärkeren Confinement-Effekt der Lichtquanten in der Goldschale, wobei die dicke Schale das Anregungslicht daran hinderte, das UCNP zu erreichen, ebenso wie die Detektion der emittierten Photonen. Eine andere UCNP-Anwendung, die in Bildgebungsverfahren und Bioassays von Interesse ist, ist ihre Kopplung an organische Farbstoffe. Da UCNP im Allgemeinen eine geringe Quantenausbeute aufweisen und daher ihre Anwendungen für die Bildgebungsverfahren nur begrenzt sind, können sie mit organischen Chromophoren gekoppelt werden, auf die die UC-Emissionsenergie durch einen Fluoreszenz Resonanz Energie-Transfer (FRET) übertragen wird. NIR-Licht zur Aktivierung von Kontrastmitteln bietet als Vorteile eine hohe Gewebedurchlässigkeit und erzeugt nahezu keine Autofluoreszenz im Vergleich zu der Aktivierung mit UV-Licht, das oft phototoxische Eigenschaften aufweist und Hintergrundfluoreszenz induziert. Zu diesem Zweck wurde ein häufig verwendeter organischer Farbstoff, Rhodamin B-Isothiocyanat (RBITC), in verschiedenen Konzentrationen in mit Silica beschichteten UCNP-Kernen gekoppelt. Nach Anregung mit NIR wurde die Emission von RBITC im Bereich von 580 nm beobachtet. Untersuchungen der UC-Emission und der Fluoreszenzlebensdauern zeigten, dass eine minimale Energieübertragung von der grünen Emission zum Farbstoff auftritt, die Emission des Farbstoffs jedoch hauptsächlich auf Reabsorption zurückzuführen ist. Ein geringer Anteil von Erbium-Ionen auf der Oberfläche transferierte seine Energie durch FRET auf den Rhodaminfarbstoff, während Reabsorption zwischen der Mehrheit der Erbium-Ionen im UCNP-Kern und den Farbstoffmolekülen in der Silicaschale auftrat. Als Nächstes wurde die Zytotoxizität von Silica-beschichteten UCNP in menschlichen Keratinozyten (HaCaT-Zellen) und murine Makrophagen (RAW 264.7-Zellen) mittels eines 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Assays untersucht. Mikroporöse Silicaschalen mit verschiedenen Dicken wurden auf 33 nm-große UCNP aufgewachsen, um die Hydrophilizität der Teilchen zu erhöhen, und dadurch das Redispergieren der Partikel im Zellkulturmedium für biologische Experimente zu ermöglichen. Ein Teil der Proben wurde anschließend mit N-(6-Aminohexyl)aminopropyltrimethoxysilane (AHAPS) funktionalisiert, das eine positive Ladung auf der NP-Oberfläche erzeugt und so deren Aufnahme in Zellen erhöht. Generell zeigen die nicht funktionalisierten Partikel eine geringere Zytotoxizität gegenüber HaCaT-Zellen als die amino-funktionalisierten Partikel. Die Ursache hierfür war eine höhere Wechselwirkung der positiv geladenen Partikel mit der negativ geladenen Zellmembran, die zu einer höheren Aufnahmerate im Vergleich zu den nicht funktionalisierten Partikeln führte. Die Dicke der Silica-Schalen beeinflusste das Ausmaß der Zytotoxizität in den HaCaT-Zellen kaum. Bei den Durchflusszytometrie-Messungen wurde die Granularität der Zellen nach Inkubation mit den Partikeln quantitativ gemessen. Die Proben mit funktionalisierten Partikeln verursachten im Vergleich zu den nicht funktionalisierten Partikeln höhere Änderungen in der Granularität der HaCaT-Zellen, was mit der höheren Zytotoxizität von Amino-funktionalisierten Partikeln in Zusammenhang stehen könnte. In den RAW 264.7-Zellen waren die Partikel mit der dünneren 7 nm-Schale aufgrund eines höheren Lanthanoid-Ionenfreisetzungsgrades im Allgemeinen zytotoxischer als die Partikel mit den dickeren 21 nm-Schalen. In den Ionenfreisetzungsexperimenten mittels Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) wurde nachgewiesen, dass mehr Lanthanoidionen aus den Partikeln mit den dünneren Schalen freigesetzt wurden, was den Zytotoxizitätsgrad der jeweiligen Proben beeinflusste. Man konnte die von Silicaschalendicke abhängige Abnahme der Zellviabilität und eine Zunahme der Granularität der Makrophagen nach Inkubation mit den Nanopartikeln beobachten.
