Funktionelle Untersuchung von genetischen Faktoren mit prognostischer Relevanz in der Onkologie

Abstract

Lungenkarzinome sind im Vergleich zu anderen Krebsarten die häufigste Todesursache weltweit. Aufgrund der späten Diagnose und einer hohen Rate an Therapieresistenzen liegt die 5-Jahres-Überlebensraten bei nur 13% und ist damit eine der niedrigsten überhaupt. Die Identifikation von potentiellen Biomarkern für eine Verbesserung der Therapieansätze rückt dabei zunehmend in den Vordergrund. Epigenetische Veränderungen spielen bei der Progression von Tumoren eine elementare Rolle, wobei diese mit der Karzinogenese und der Ausprägung einer Therapiereistenz in Verbindung stehen. Epigenetische Modifikatoren wie die H3K4-Methyltransferase KMT2D und das Chromatin-Bindeprotein (Reader) BRD4 sind häufig in verschiedenen Krebsarten wie z.B. in NSCLC mutiert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollten in verschiedenen Lungenkrebszelllinien unter Verwendung von CRISPR CAS9 definierte Mutationen in den Kandidatengenen KMT2D und BRD4 induziert werden, um funktionelle Mechanismen eingehender zu untersuchen, die mit einer Tumorprogression assoziiert werden. Die Deletionen im Kandidatengen KMT2D unterscheiden sich dadurch, dass bei einer der Deletionen ein Verlust der SET-Domäne erfolgt (Zelllinie B6), wohingegen bei der anderen Deletion das Leseraster C-terminal und damit auch die SET-Domäne erhalten bleibt (Zelllinie A76). In BRD4 wird eine Deletion des gesamten Gens eingefügt. In ChIP-Seq –Analysen der Parental-Zelllinien erfolgte zunächst die Identifikation spezifisch angereicherter Signalwege, die in Prozessen der zellulären Stressantwort, dem Spleißprozess und der epigenetischen Regulation eine Rolle spielten. Zudem konnte eine starke Anreicherung im EGFR-Signalweg festgestellt werden. Um die mögliche Auswirkung der induzierten Mutationen in diesen identifizierten Signalwegen eingehender zu betrachten, wurden diese in Expressions-, Proliferations- und methylierungsspezifischen Experimenten analysiert. Des Weiteren wurde der Einfluss von KMT2D auf eine epigenetisch bedingte Therapieresistenz gegen die EGFR-wirkenden Chemotherapeutika Cetuximab und Erlotinib untersucht. Die induzierten Mutationen führten zu einer verminderten RNA- und Proteinexpression der Kandidatengene. Bei der KMT2D-Zelllinie A76 konnten deutliche morphologische Veränderungen beobachtet werden. Die Zellproliferation war in der Analyse verglichen zur Parental-Zelllinie HCC827 deutlich in den KMT2D-mutierten Zelllinien vermindert. In den Western Blot Analysen führten die induzierten KMT2D- und BRD4-Mutationen zu Veränderung der gesamten Histon-Mengen, die sich in einer differenziellen H3K4- und H3K27-Methylierung in den mutierten Zelllinien widerspiegelten. Durch einen Hitzestress konnte eine Stabilisierung der methylierten Histon-Mengen beobachtet werden. Zudem wurden Unterschiede in der Zellviabilität nach der Induktion durch einen Hitzestress ermittelt. In den BRD4-mutierten Zelllinien konnten hingegen keine Unterschiede in der Zellviabilität nach einem Hitzeschock im Vergleich zur parentalen Zelllinie Wi38 festgestellt werden. Die KMT2D-Mutationen resultierten in einer veränderten RNA-Expression von H3K4- und H3K27-relevanter Methyltransferasen und Demethylasen. Zudem konnten Veränderungen in der Expressionsanalyse von U2 snRNP Spleiß-Faktoren in den KMT2D- und BRD4-mutierten Zelllinien festgestellt werden. Bei der KMT2D-Mutante A76 konnte zudem in Zellviabilitätsassays eine erhöhte Sensitivität gegenüber Cetuximab und Erlotinib beobachtet werden.