Wenn sich Bakterien der stationären Phase nähern, reduziert sich ihre Teilungsrate, die metabolischen Aktivitäten werden zurück gefahren und die Translationsaktivität der Ribosomen nimmt rapide ab. Letzteres bedingt den wohlbekannten Effekt, daß Ribosomen, isoliert von Zellen aus der stationären Phase, nur eine geringe Aktivität in vitro haben. Wir haben nur geringe Kenntnis von den Ursachen der reduzierten ribosomalen Aktivität („silencing“) während der stationären Phase und unter Stressbedingungen. Faktoren wie RMF, HPF und sein Homolog PY wurden vorgeschlagen, über Dimerisation von 70S inaktive 100S Partikel zu bilden. Jedoch gibt es keine Übereinstimmung über die Rolle und das Auftauchen dieser Partikel. Ferner ist bekannt, daß die Entfernung des RMF Gens die Lebensfähigkeit von E. coli Zellen in der stationären Phase verschlechtert. Weiterhin wurden 100S Partikel auch in logarithmischer Phase beobachtet, was heißen mag, daß die 100S Partikel eine andere Rolle spielt oder weitere Funktionen besitzt. Wir präsentieren hier eine Studie des kürzlich von uns und mit meiner Beteiligung beschriebenen „Ribosome Silencing Factor“ (RsfS, früherer Name YbeB), ein Protein das mit Ribosomen assoziiert ist. RsfS kommt fast in allen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten vor und bindet an L14 der großen, ribosomalen Untereinheit, eines der am besten konservierten Proteine des Ribosoms. Die Wechselwirkung von RsfS mit L14 ist vom Bakterien bis zum Menschen konserviert. Wir zeigen, daß RsfS wichtig für das Überleben ist, wenn immer die Wachstumsrate herunter gefahren werden muß, d.h. während des Übergangs von der logarithmischen zur stationären Phase oder vom reichen zum armen Medium. Im letzteren Fall ist das Wachstum blockiert, bis es nach etwa 15 h langsam wieder Fahrt aufnimmt. Entfernung des RsfS Gens erhöht die Translationsaktivität in der stationären aber nicht in der logarithmischen Phase. In vitro hemmt RsfS und sein mitochondriales Homolog die Translation über die Bindung an L14 in der großen ribosomalen Untereinheit und blockiert damit die 70S Bildung aus Untereinheiten oder dissoziiert leere 70S Ribosomen. Interessanterweise wird die Effizienz zur Dissoziation empfindlich gestört, wenn programmierte Ribosomen tRNAs tragen. RsfS hemmt nicht die Translation von chemisch vernetzten 70S Ribosomen, woraus wir schließen, daß die Translationshemmung zum wesentliche Teil auf Dissoziation der 70S Ribosomen bzw. Hemmung der Assoziation der ribosomalen Untereinheiten zurückgeführt werden kann. Wir haben auch RsfS mit den Faktoren RMF, PY und HPF genetisch und funktionell verglichen, um die jeweilige Bedeutung und eine mögliche Kooperation zu entdecken. Wir fanden, (i) daß 100S Bildung keine obligates Merkmal der stationären Phase ist, (ii) daß der schwere Phänotyp des ΔrsfS Stammes mit entsprechenden KO-Mutanten der drei anderen Faktoren nicht beobachtet wird, (iii) daß die Lebensfähigkeit von ΔrsfS Zellen und besonders der Δrmf Zellen, aber nicht der Δhpf or Δpy stark eingeschränkt ist, und daß schließlich in vitro RsfS die stärkste Translationshemmung sowohl bei natürlichen mRNAs als auch bei hoch definierten Elongationsexperimenten zeigt. Die Hemmung der anderen Faktoren ist additiv, nicht kooperativ. Zusammengefaßt zeigen unsere Daten, daß RsfS eine Schlüsselrolle für das ribosomale “silencing” hat, wobei es von den anderen Faktoren unterstützt wird.
Bacterial cells approaching stationary growth phase reduce division rates, cut back metabolic activities and thus decrease protein translation causing the well-known effect that ribosomes isolated from stationary growth phase show a low translational activity. We have a scarce knowledge about the mechanism of ribosome silencing during stationary growth phase or under stress condition. HPF, its homolog PY and RMF have been proposed to bring translation to a halt by dimerization of 70S ribosomes into 100S particles. However, there is no consensus about the function or occurrence of 100S particles. Deletion of RMF decreases the viability of E. coli in stationary growth phase. On the other hand, 100S particles have been observed also in logarithmic growth phase, suggesting that 100S particles have a different role than ribosome silencing. Here we present a study of the recently (with my participation) described Ribosome Silencing Factor S (former name YbeB), a protein associated with ribosomes. RsfS is present in almost all bacteria, mitochondria and chloroplasts and binds to protein L14, one of the most conserved proteins of the large ribosomal subunit. This interaction is conserved from bacteria to man. We demonstrate that RsfS is important for cell survival, whenever the growth rate has to be decreased, i.e. during the transition from the logarithmic growth phase to the stationary growth phase and from rich to poor media. In the latter case ΔrsfS strain stops growing for about 15 h before growth is launched again. Deletion of RsfS gene increases the translation activity during stationary growth phase but not during logarithmic growth phase. In vitro RsfS and its mitochondrial homolog inhibits translation by binding to 50S protein L14 and thus i) inhibits 70S formation from subunits and ii) dissociates empty 70S ribosomes. Interestingly, the efficiency of 70S dissociation decreases, when 70S is programmed with tRNA at the P site. RsfS does not inhibit translation of non dissociable 70S suggesting that ribosome silencing by RsfS is mediated predominantly via 70S dissociation or anti- association of the ribosomal subunits. We also compared RsfS with RMF, PY and HPF to elucidate the importance and possible interplay between these factors in ribosome silencing. We found that i) 100S formation is not an obligatory feature of stationary-phase E. coli cells; ii) the strong phenotype of ΔrsfS strain, viz. a block of growth for about 15 h after transfer from rich to poor media, is not seen with the knock-out of one of the other factors; (iii) viability at stationary phase is impaired in ΔrsfS cells and even stronger in Δrmf cells, but not in Δhpf or Δpy cells; (iv) RsfS is the only factor that impairs translation in stationary growth phase; (v) in vitro RsfS shows the strongest inhibition in both translation of natural mRNAs and in highly resolved elongation assays; the inhibition of the other factors is additive, not cooperative. Collectively, the data indicate that RsfS plays a key role in silencing the ribosomal activity under conditions characterized by a reduced growth rate, and that it is supported by the other silencing factors.
