HIF-stabilization to accelerate fracture healing – Evaluation of a new therapeutic strategy to treat delayed bone regeneration

Abstract

The hypoxic microenvironment during the initial phase of fracture healing is essential for initiating immunological process that further the regeneration and restoration of the bone. The hypoxia-inducible factor (HIF)-1α closely regulates the cellular adaption under hypoxic conditions. HIF-1α can be chemically stabilized by different factors which either inhibit the O2-sensing prolyl hydroxylase e.g. deferoxamine (DFO) or directly interfere with the downstream effects after nuclear translocation e.g. the macrophage-migration inhibitory factor (MIF). As a transcription factor, HIF-1α initiates the consecutive processes of bone regeneration and human mesenchymal stromal cell (hMSC) differentiation. Hence, the aim was to promote the cellular adaptation towards hypoxia in order to specifically accelerate fracture healing under compromised conditions (inhibited mineralization and vascularization). First, in vitro studies were performed to i) evaluate the potential of DFO and MIF in combination to counteract a glucocorticoid-induced inhibition of hMSC calcification and ii) determine an effective concentration of both substances for further testing in a mouseosteotomy-model. Concurrently, two absorbable bovine Col I scaffolds (ACSs) were tested for their suitability to be used as a delivery system of these substances into the osteotomy gap. Finally, both HIF-stabilizers were evaluated for their potential to accelerate fracture healing in a mouse-osteotomy-model. In vitro, a concentration-dependent inhibitory effect of the glucocorticoid dexamethasone was observed on osteogenic differentiation and calcification of hMSCs via a quantitative Alizarin red assay. This inhibition was counteracted by applying different concentrations DFO and MIF in combination. As suitable scaffolds for the in vivo application Lyostypt® (ACS-L) and Helistat® (ACS-H) were investigated in vitro for their structural components and impact on hMSC osteogenesis, cytotoxicity and immunogenicity. Proteomics analysis of both scaffolds yielded several proteins beside collagens that might be advantageous or disadvantageous regarding the fracture healing outcomes. Moreover, ACS-H induced a strong tumor necrosis factor (TNFα) release when applied to whole human blood and inhibited the calcification during the osteogenic differentiation of hMSCs. Consequently, ACS-L was examined in more detail in a mouse-osteotomy-model and revealed an inhibitory effect on mineralized callus formation, cellular recruitment to the osteotomy gap and vessel formation. The application of DFO and MIF in combination and DFO alone during the initial healing phase accelerated the vessel formation, the ACS degradation and the callus mineralization. The results support the fact that stabilization of HIF-1α enhances osteogenic differentiation in vitro and is capable to counteract e.g. glucocorticoid-induced inhibition. Both ACSs negatively influenced either the hMSC differentiation in vitro or the bone healing process in vivo, although being routinely used in research and clinic routine. These results display a delayed healing process that parallels observed compromised conditions in Rheumatoid arthritis patients or smokers – reduced vessel and bone formation. The combination of MIF and DFO was evaluated in this model of compromised condition to test their counteracting ability in this clinically relevant model. This study provides evidence for a promising therapeutic strategy to accelerate fracture healing capacities and to prevent disorders by applying potent HIF-stabilizers in a specific patient cohort with a higher risk of a bone healing delay.

Das hypoxische Mikromilieu während der initialen Phase der Frakturheilung ist essenziell für die Knochenregeneration und -wiederherstellung. Dadurch werden wichtige immunologische Prozesse für den weiteren Verlauf der Heilung angeschoben. Der Hypoxie-induzierte Faktor (HIF)-1α reguliert maßgeblich die zelluläre Adaptation unter hypoxischen Bedingungen. HIF-1 α kann durch verschiedene Faktoren chemisch stabilisiert werden, wobei diese entweder die O2-sensitive Prolyl-Hydroxylase hemmen, wie z.B. Deferoxamin (DFO) oder direkt mit dem Signalweg nach HIF-Translokation in den Nukleus interagieren, wie z.B. der Macrophage-migration Inhibitory Factor (MIF). Als Transkriptionsfaktor aktiviert HIF-1α wichtige Schritte der Knochenregeneration, wie z.B. die Differenzierung von humanen Mesenchymalen Stromazellen (hMSC) oder die Gefäßbildung. Dementsprechend ist die Förderung der zellulären Adaptation gegenüber Hypoxie ein vielversprechender Ansatz und Inhalt dieser Arbeit, um die Frakturheilung vor allem unter kompromittierten Bedingungen (Hemmung der Mineralisierung und Vaskularisierung) zu verbessern. In einem ersten Schritt wurden In-vitro-Studien durchgeführt um (i) das Potential von MIF und DFO in Kombination zu testen, einer Glukokortikoid-induzierten Hemmung der Kalzifizierung von hMSCs entgegenzuwirken und (ii) die optimale Dosierung beider Substanzen für weitere Studien in vivo zu bestimmen. Parallel dazu wurden zwei absorbierbare bovine Kollagen-I Scaffolds (ACS) auf ihre Eignung, als Trägermaterialien für die Substanzkombination für die weiteren In-vivo-Testung zu dienen, evaluiert. Im letzten Schritt wurde der Effekt von MIF und DFO nach lokaler Applikation in einem Maus-Osteotomie-Modell untersucht. In vitro wurde ein konzentrationsabhängiger hemmender Effekt des Glukokortikoids Dexamethason auf die osteogene Differenzierung und Kalzifizierung von hMSC mittels quantitativem Alizarin-Rot-Assay beobachtet. Diese Hemmung konnte durch Applikation von verschiedenen Konzentrationen von MIF und DFO in Kombination aufgehoben werden. Die ausgewählten Scaffolds für die In-vivo-Studien, Lyostypt® (ACS-L) und Helistat® (ACS-H), wurden einer genaueren Analyse ihrer strukturelle Beschaffenheit und ihres potentiellen Einfluss auf die osteogene Differenzierung von hMSC, Zytotoxizität und Immunogenität unterzogen. Mittels Proteomics-Analysen konnten neben den zu erwartenden Kollagenen weitere Proteine, die potenziell die Knochenregeneration beeinflussen können, nachgewiesen werden. Weiterhin induzierte ACS-H eine signifikante Freisetzung des Tumor-Nekrosefaktors (TNF)-α in humanem Vollblut und hemmte die Kalzifizierung von hMSC während der Osteogenese. Folglich wurde nur ACS-L für weitere In-vivo-Studien eingesetzt. Dieser zeigte nach Applikation in einem Maus-Osteotomie-Modell eine hemmende Wirkung auf die mineralisierte Kallusformation, die Zellmigration in den Osteotomiespalt und die Gefäßbildung. Die Applikation von DFO und MIF oder nur DFO allein konnte diesem hemmenden Effekt entgegenwirken. Die Ergebnisse der Studie unterstützen den Fakt, dass die Stabilisierung von HIF-1α, die osteogene Differenzierung in vitro fördert und z.B. Glukokortikoid-induzierten negativen Effekten entgegenwirken kann. Interessanterweise zeigten beide Scaffolds eine hemmendende Wirkung auf hMSC in vitro oder den Knochenregenerationsprozess in vivo, obwohl sie beide routinemäßig in der Klinik oder Forschung zur Behandlung von Knochenbrüchen eingesetzt werden. Die Nutzung des ACS-L, als Trägermaterial, für die In-vivo-Studien ist entsprechend den hier gewonnen Daten eher vergleichbar mit kompromittierenden Bedingungen, wie sie z.B. während der Knochenheilung in Rheuma-Patienten oder Rauchern beobachtet werden (reduzierte Knochen- und Gefäßbildung). Die Kombination von MIF und DFO wurde in diesem Modell untersucht und konnte in einem klinisch-relevanten Modell ihr Potential zur Verbesserung der Knochenregeneration zeigen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind äußerst vielversprechend im Hinblick auf die mögliche Therapie von spezifischen Patientenkohorten, die zu Frakturheilungsstörungen neigen, mit HIF-Stabilisatoren, um die Knochenregeneration nebenwirkungsarm zu fördern.