Comparative cephalometric studies of the mandible in growing Göttingen Minipigs using 3D Computed Tomography: Refining experimental dental and orofacial research

Abstract

This thesis was created as a subproject of the Berlin-Brandenburg Research Platform, with the integrated graduate school "Innovations in the 3R Research - Genetic Engineering, Tissue Engineering and Bioinformatics". BB3R was established under the umbrella of the Dahlem Research School (DRS) of Freie Universität Berlin and aims to provide substantial progress in 3R alternatives by intensive systematic research. The overarching objective of this thesis was to establish an anatomical data collection with detailed and age-related data of the mandible and the mandibular canal of growing Göttingen Minipigs using 3D Computed Tomography and to compare this data with human mandibular anatomy. Therefore, it could be determined, whether the Göttingen Minipig represents an anatomically suitable animal model for orofacial surgery. In order to refine and avoid intra- and postoperative complications in the sense of the 3Rs, this data collection should be prospectively used in dental and orofacial experiments. Chapter 1 generally introduces the market size, sales figures and the utilization of dental implants in dentistry and orofacial reconstructive surgery. It also focusses on the required preclinical testing procedures to proof the implants’ biocompatibility and safety in order to be authorized for clinical testing in humans. This involves in vivo testing in large animal models. Due to stricter legal requirements over the use of primates for scientific purposes, the Göttingen Minipig is nowadays extensively used as animal model in pre-clinical dental and orofacial research. Nevertheless, several authors have raised concerns over the use of the Göttingen Minipig in this research area, observing complications and success rates below 60%. Chapter 2 gives a literature review about the development of different minipig breeds, their general scientific use and the corresponding German and European animal research numbers. Then the reader is introduced to the role of the Göttingen Minipig in dental and orofacial research, how the in vivo procedures are performed and what complications can occur. In addition, the European law, the definitions of the 3Rs and their implementation in research are elucidated. At the end of the chapter, the technical methodologies (CT, 2D and 3D reconstruction, Cephalometry and visualization software) used in this study, are explained. Chapter 3 lists the detailed objectives of the thesis. Chapter 4 covers the publication “Refining experimental dental implant testing in the Göttingen Minipig using 3D computed tomography – A morphometric study of the mandibular canal”. In this study, morphometric and age-related data of the mandibular canal and the alveolar ridge of the Göttingen Minipig was reported and compared with the human anatomy, in order to avoid complications during in vivo testing of endosseous dental implants. Using 3D computed tomography, six parameters of the mandibular canal as well as the alveolar bone height and the alveolar ridge width were measured in Göttingen Minipigs aged 12, 17 and 21 months. The study found that the volume, length and depth of the mandibular canal all increased with age. The width of the canal did not change significantly with age. There were high individual differences within each age group, for example within the 21 months old group the animal with the lowest canal volume of 4.7ml was 14kg heavier than the animal with the significantly highest volume of 13.4ml. In contrast to humans, minipigs possess a significantly larger mandibular canal. With higher age and increasing canal volume, loss of deep spongy bone in the posterior premolar and molar regions could be observed, which potentially results in the inferior alveolar neurovascular bundle coming into close proximity with the tooth roots. This reduced the available space for dental implants and could negatively affect implant stability and the integrity of the inferior alveolar neurovascular bundle. This problem is aggravated by the minipigs’ narrower alveolar ridge width in comparison with healthy humans. Surprisingly, the body mass does not have an influence on any of the measured parameters. When one images the inferior alveolar vein, two basic patterns occur. One being a straight traverse, the other being a variable undulating route where it rises and falls as it travels through the length of the canal. Dynamic anatomical changes could be proven until the age of 21 months. Due to ongoing growth it is inadvisable to use minipigs younger than 21 months in experimental implant dentistry. Paradoxically, the measurements of the 12 months old pigs indicate a closer alignment of their mandibular anatomy to that of humans, suggesting that they may be better models for implant studies. Given the variability in mandibular canal dimensions in similar age cohorts, the use of imaging techniques is essential for the selection of individual minipigs for the interventions and thus higher success rates. Chapter 5 covers the publication “Cephalometric studies of the mandible, its masticatory muscles and vasculature of growing Göttingen Minipigs – A comparative anatomical study to refine experimental mandibular surgery”. This study elucidated how comparable the mandible of Göttingen Minipigs and humans are, and whether the frequently reported complications could be caused by specific anatomical characteristics of the minipigs’ mandible, its masticatory muscles and associated vasculature. Therefore, twenty-two mandibular cephalometric parameters were measured on CT scans of Göttingen Minipigs aged between 12 and 21 months. Of the 22 parameters measured, only four were found to be highly comparable, whilst the others were not. Again, especially younger minipigs showed a closer alignment to human anatomy. Minipigs generally showed a higher mandibular ramus, anterior mentum height and a significantly longer mandible with a much steeper mandibular angle. They in contrast possess a shorter superior ramus length and a lower coronoid process volume. The 3D examinations of the minipigs’ vasculature pictured a large, tortuous network medial to the mandibular ramus, mainly consisting of the very prominent deep facial vein and maxillary artery. This vascular complex interferes with the principal sectional plane for MDO that could cause strong and inaccessible bleeding. The morphology and dimensions of the mandibular body in humans and minipigs are very different. Whilst humans have a mandibular body with an ovoid cross-section, that of minipigs can be pear-shaped. Consequently, bicortical screws that are positioned in the inferior part of the mandibular body as routinely performed in humans, could, when placed in a similar way in a Göttingen Minipig, cause trauma to the inferior alveolar nerves and vessels. Bicortical screws implanted in the inferior cortex would probably have impaired stability, due to the thin inferior bone thickness. Literature revealed that the dynamics of mastication in pigs and in humans differ greatly. Pigs have a higher crushing force and closing velocity than humans. In addition, they postoperatively grind their teeth extensively as well as bite on hard objects such as their cages that could potentially impair wound healing and implant stability. Based on the results of this study, the authors consider the Göttingen Minipig not to be an anatomically ideal animal model for experimental mandibular surgery research. The minipig mandible not only differs greatly from that of humans but also is highly variable in its morphology within animals of the same age group. This raises concerns, that extrapolating acquired scientific results of Göttingen Minipigs to humans could be misleading or incorrect. Due to the lack of alternative large animal models, the authors recommend to precisely plan mandibular surgical experiments based on radiographic techniques, such as Computed Tomography, and to choose suitable age groups and use customized implants based on the mandibular dimensions as reported in this study. Chapter 6 more precisely discusses the suitability of Göttingen Minipigs as an animal model for dental and orofacial research. In addition, alternative animal models for the Göttingen Minipigs, with their anatomical and physiological advantages and disadvantages are, in regards to the recommendations of the ISO 7405:2018, discussed. The chapter ends with conclusive remarks, while giving an outlook on a database planned in the future.

Die vorliegende Doktorarbeit entstand als Teilprojekt der Berlin-Brandenburger Forschungsplattform BB3R mit integriertem Graduiertenkolleg „Innovationen in der 3RForschung - Gentechnik, Tissue Engineering und Bioinformatik”, welche unter dem Dach der Dahlem Research School (DRS) der Freien Universität Berlin gegründet wurde. Das Ziel von BB3R ist die breite Implementierung von Alternativmethoden und tierschonenden Verfahren in der Forschung. Übergeordnetes Ziel dieser Dissertation war es, eine anatomische Datensammlung mit detaillierten und altersbezogenen Daten des Unterkiefers und des Unterkieferkanals von heranwachsenden Göttinger Minischweinen mittels 3DComputertomographie zu erstellen und diese Daten mit solchen der menschlichen Unterkieferanatomie zu vergleichen. Dadurch konnte festgestellt werden, ob das Göttinger Minischwein ein anatomisch geeignetes Tiermodell für die orofaziale Chirurgie darstellt. Um ein Refinement im Sinne der 3R zu erzielen und intra- und postoperative Komplikationen zu vermeiden, sollte diese Datensammlung prospektiv in der experimentellen dentalen und orofazialen Chirurgie an Göttinger Minischweinen eingesetzt werden. Kapitel 1 stellt das Marktvolumen, die Verkaufszahlen und die Verwendung von Implantaten in der Zahnheilkunde und der orofazialen rekonstruktiven Chirurgie vor. Ebenso werden die erforderlichen präklinischen Testverfahren zum Nachweis der Biokompatibilität und Sicherheit von Implantaten erläutert, um für die klinische Erprobung am Menschen zugelassen zu werden. Hierfür werden häufig in-vivo-Tests an Großtiermodellen durchgeführt. Aufgrund strengerer gesetzlicher Vorgaben an Tierversuche mit Primaten, wird das Göttinger Minischwein heute sehr häufig als Tiermodell in der präklinischen zahnärztlichen und orofazialen Forschung eingesetzt. Trotz allem haben sich mehrere Autoren hinsichtlich der Verwendung des Göttinger Minischweins in diesem Forschungsbereich kritisch geäußert, da sehr viele Komplikationen und ein geringer Prozentsatz erfolgreicher Setzungen von Implantaten, teilweise unter 60%, beobachtet wurden. Kapitel 2 gibt eine Literaturübersicht über die Entwicklung der verschiedenen Minipig-Rassen, ihre allgemeine wissenschaftliche Verwendung und die entsprechenden deutschen und europäischen Tierversuchszahlen. Anschließend wird der Leser in die Rolle des Göttinger Minipigs in der dentalen und orofazialen Forschung eingeführt und mit den Abläufen von invivo-Eingriffen und deren Komplikationen vertraut gemacht. Darüber hinaus werden das europäische Recht, die Definitionen der 3Rs und deren Umsetzung in der Forschung erläutert. Am Ende des Kapitels werden die technischen Methoden (CT, 2D- und 3D-Rekonstruktion, Kephalometrie und Visualisierungssoftware) erklärt, die in dieser Studie verwendet wurden. Kapitel 3 listet die detaillierten Ziele der Arbeit auf. Kapitel 4 beinhaltet die Publikation „Refining experimental dental implant testing in the Göttingen Minipig using 3D computed tomography – A morphometric study of the mandibular canal“. In dieser Studie wurden morphometrische und altersbezogene Daten des Unterkieferkanals und des Alveolarkamms des Göttinger Minischweins gemessen und mit der menschlichen Anatomie verglichen, um Komplikationen bei in-vivo-Tests enossaler Zahnimplantate zu vermeiden. Mittels 3D-Computertomographie wurden an Göttinger Minischweine im Alter von 12, 17 und 21 Monaten sechs Parameter des Unterkieferkanals, sowie die Höhe des Alveolarknochens und die Breite des Alveolarkamms gemessen. Die Studie ergab, dass Volumen, Länge und Tiefe des Unterkieferkanals mit dem Alter zunahmen. Die Breite des Kanals änderte sich mit dem Alter nicht signifikant. In jeder Altersgruppe konnten große individuelle Unterschiede festgestellt werden. Aus der Gruppe der 21 Monate alten Minischweine war das Tier mit dem niedrigsten Kanalvolumen von 4,7 ml 14 kg schwerer als das Tier mit dem höchsten gemessenen Volumen von 13,4 ml. Minischweine besitzen im Gegensatz zum Menschen einen deutlich größeren Unterkieferkanal. Mit zunehmendem Alter und zunehmendem Kanalvolumen konnte ein Verlust von tiefem spongiösem Knochen im hinteren Prämolar- und Molarbereich beobachtet werden, was möglicherweise dazu führt, dass sich die Gefäße und der dazugehörige Nerv des Unterkieferkanals unmittelbar an die Zahnwurzel annähert. Dies führt zur Reduktion von verfügbarem Knochen für die Setzung von Zahnimplantaten und zu verringerter Stabilität und Integrität und kann die Verletzungsgefahr der Leitungsstrukturen im Unterkieferkanal erhöhen. Dieses Problem wird durch einen, im Vergleich zum gesunden Menschen schmaleren Alveolarkamm noch einmal verschärft. Überraschenderweise hat das Körpergewicht keinen Einfluss auf die gemessenen Parameter. Bei der Visualisierung der Vena alveolaris inferior, treten zwei Konfigurationsmuster auf. Einerseits ein gerader, andererseits ein variabler Verlauf mit korkenzieherartigen Windungen, die sich während der Route durch den Kanal auf und ab bewegen. Kieferwachstum konnte bis zum Alter von 21 Monaten nachgewiesen werden. Aufgrund des anhaltenden Wachstums ist es daher nicht ratsam, Minischweine die jünger als 21 Monate sind, in Studien zu Zahnimplantaten einzusetzen. Paradoxerweise zeigen die Messungen an 12 Monate alten Minischweinen eine bessere anatomische Vergleichbarkeit, was diese Altersgruppe für Zahnimplantatsstudien potenziell geeigneter macht. Angesichts der hohen Variabilität der Unterkieferkanaldimensionen in Tieren gleicher Altersklassen, ist der Einsatz bildgebender Verfahren zur Auswahl einzelner Minischweine und zur Erhöhung der Erfolgsaussichten von chirurgischen Interventionen von entscheidender Bedeutung. Kapitel 5 befasst sich mit der Veröffentlichung „Cephalometric studies of the mandible, its masticatory muscles and vasculature of growing Göttingen Minipigs – A comparative anatomical study to refine experimental mandibular surgery“. In dieser Studie wurde untersucht, wie vergleichbar der Unterkiefer von Göttinger Minischweinen und Menschen ist und ob die häufig auftretenden Komplikationen bei Göttingen Minipigs durch spezifische anatomische Merkmale des Unterkiefers, seiner Kaumuskulatur und Gefäße verursacht werden. Daher wurden 22 zephalometrische Parameter an CT-Aufnahmen des Unterkiefers Göttinger Minischweine im Alter zwischen 12 und 21 Monaten gemessen. Von diesen 22 Parametern erwiesen sich nur vier als gut vergleichbar, die anderen dagegen nicht. Wiederum zeigten insbesondere jüngere Minischweine eine bessere Übereinstimmung zur menschlichen Anatomie. Minipigs hatten im Allgemeinen einen höheren Kieferast, ein höheres Kinn und einen signifikant längeren Unterkiefer mit deutlich steilerem Unterkieferwinkel. Sie besitzen im Gegensatz zum Menschen einen kürzeren oberen Kieferastbereich und ein geringeres Volumen des Processus coronoideus. Die 3D-Visualisierung des Gefäßsystems der Minischweine zeigten ein ausgedehntes, gewundenes Netzwerk medial des Unterkieferastes, das hauptsächlich aus der sehr ausgeprägten, tiefen Gesichtsvene und der Oberkieferarterie bestand. Dieser Gefäßkomplex interferiert mit der Schnittführung von Unterkiefer-Distraktionsosteogenesen, was starke und unzugängliche Blutungen zur Folge haben kann. Die Morphologie und Dimensionen des Unterkieferkörpers von Mensch und Minischwein sind sehr unterschiedlich. Während Menschen einen Unterkieferkörper mit hochovalem Querschnitt besitzen, kann der von Minischweinen Birnenform annehmen. Infolgedessen könnten bikortikale Schrauben, die beim Menschen im unteren Teil des Unterkiefers routinemäßig eingesetzt werden, bei vergleichbarer Positionierung im Minischwein, zu Verletzungen des Unterkiefernerv und der Gefäße führen. Bikortikale Schrauben, die in die untere Kortikalis implantiert werden, würden zudem höchstwahrscheinlich aufgrund der dünnen Wandstruktur eine beeinträchtigte Stabilität besitzen. Der Fachliteratur war zu entnehmen, dass die Dynamik des Kauvorgangs von Schweinen und Menschen sehr unterschiedlich ist. Schweine haben eine höhere Mahlkraft und Schließgeschwindigkeit Außerdem knirschen sie postoperativ ausgiebig mit den Zähnen und kauen auf harten Gegenständen wie Käfigstangen, was möglicherweise die Wundheilung und die Stabilität des Implantats beeinträchtigen könnte. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie bewerten die Autoren das Göttinger Minischwein als ein anatomisch nur bedingt geeignetes Tiermodell für die experimentelle dentale und orofaziale Forschung. Der Unterkiefer des Minipigs unterscheidet sich nicht nur stark von dem des Menschen, sondern ist in seiner Morphologie auch bei Tieren gleicher Altersgruppen sehr unterschiedlich. Dies gibt Anlass zur Sorge, dass die Übertragbarkeit der von Göttingen Minischweinen erworbenen wissenschaftlichen Ergebnisse auf den Menschen, irreführend oder falsch sein könnten. Aufgrund des Fehlens alternativer Großtiermodelle, empfehlen die Autoren die sorgfältige Planung chirurgischer Eingriffe am Unterkiefer mittels bildgebenden Verfahren wie der Computertomographie, um auf Grundlage der in dieser Dissertation angegebenen Dimensionen maßgeschneiderte Implantate und geeignete Altersklassen zu entwerfen und auszuwählen. In Kapitel 6 wird die Eignung des Göttinger Minischweins als Tiermodell für die dentale und orofaziale Forschung diskutiert. Darüber hinaus werden alternative Tiermodelle mit ihren anatomischen und physiologischen Vor- und Nachteilen aufgeführt und mit den Empfehlungen der ISO 7405:2018 diskutiert. Das Kapitel endet mit abschließenden Bemerkungen und Denkanstößen und gibt einen Ausblick auf eine geplante Datenbank.