Bitterstoffe sind ubiquitar in der Natur und unserer taglichen Umwelt verbreitet und zeichnen sich durch eine ausgesprochen hohe chemische Diversitat aus (Barratt-Fornell et al., 2002; Belitz und Wieser, 1985; Biere et al.; 2004; DuBois et al., 2008; Edreva et al., 2008). Es wird angenommen, dass sich die Bittergeschmackswahrnehmung als eine Warnfunktion vor sich in der Nahrung befindlichen gesundheitsschadlichen Stoffen entwickelt hat (Lindemann, 1996). Die Wahrnehmung der Bitterstoffe erfolgt uber 25 G-Protein gekoppelte Rezeptoren, von denen sich die bis dato 21 deorphanisierten TAS2Rs (taste 2 receptor) durch ein individuelles Agonistenspektrum auszeichnen (Meyerhof et al., 2010a). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass fast die Halfte der Testverbindungen mehr als einen TAS2R aktvierten (Meyerhof et al., 2010). In einer Studie von Brockhoff und Kollegen (2011) wurden zwei Substanzen gefunden, welche sowohl als Agonisten sowie auch als Antagonisten verschiedener Bittergeschmacksrezeptoren identifiziert wurden (Brockhoff et al., 2011). In Anknupfung an diese Resultate sollte untersucht werden, ob bei Bitterstoffen das gleichzeitige fungieren als Antagonist und Agonist unterschiedlicher Teilmengen von Bittergeschmacksrezeptoren ein haufiges Phanomen darstellt. Dazu wurden 52 Substanzen als Antagonisten auf acht Rezeptoren (TAS2R9, -R10, -R14, -R16, -R38, -R43, -R46, -R50), welche aufgrund ihrer unterschiedlichen Eigenschaften ausgewahlt wurden, untersucht. Mittels heterologer Expression der TAS2Rs in HEK 293T-Zellen, welche stabil mit der GProtein Gα16gust44-Unterheit transfiziert waren, wurden funktionelle Calciumanalysen durchgefuhrt. Dabei wurde die Hohe der relativen Fluoreszenzsignale zwischen der alleinigen Applikation des Agonisten und der simultanen Zugabe des Agonisten und der Testsubstanzen verglichen. In der vorliegenden Arbeit konnten 20 bisher unbekannte Antagonisten von humanen Bittergeschmacksrezeptoren identifiziert werden. Diese zeigten zumeist eine individuelle Auspragung der inhibitorischen Potenz und Effizienz auf die Rezeptoren, wobei acht Substanzen auf mehr als einen TAS2R als Antagonisten wirkten. Drei Substanzen (Chloroquin, Allylisothiocyanat, Phenanthrolin) konnten als breitbandig wirkende Inhibitoren identifiziert werden, welche das Agonisten-induzierte Calciumsignal von sechs bis acht Bittergeschmacksrezeptoren reduzierten. Dosis-Wirkungs-Experimente zeigten, dass Chloroquin (auf TAS2R16 und -R38) und Phenanthrolin (auf TAS2R10 und -R46) als insurmountable Antagonisten fungierten. Auf TAS2R50, fur den nur zwei Agonisten bekannt sind (Meyerhof et al., 2010), zeigten 14 der Testsubstanzen ein antagonistisches Potential. Die Substanz Hardwickische Saure (FL101237) wurde auf alle 21 deorphanisierten TAS2Rs als Antagonist getestet. Auf 19 Rezeptoren zeigte FL101237 eine inhibitorische Wirkung, wobei das relative Fluoreszenzsignal von elf TAS2Rs durch die simultane Applikation des Agonisten und FL101237 vollstandig inhibiert wurde. Fur TAS2R1 stellte sich FL101237 als Agonist, fur TAS2R46 als partieller Agonist, heraus. Erstmalig konnte in der vorliegenden Arbeit in diesem Umfang gezeigt werden, dass Bittersubstanzen gleichzeitig als Agonisten und Antagonisten verschiedener teils uberlappender Teilmengen von Bittergeschmacksrezeptoren fungieren konnen. Das Ligandenspektrum der TAS2Rs ist vermutlich groser als bisher angenommen und die Ergebnisse dieser Arbeit zeichnen ein neues Bild der Komplexitat der Bittergeschmacksstoffwahrnehmung. Es scheint, dass der evolutionare Druck Bittersubstanzen zu erkennen zu der Ausbildung der Vielzahl an Rezeptoren mit uberlappenden Agonistenspektren gefuhrt hat, um sicher zu stellen, dass toxische Substanzen auch vermengt mit Bitterinhibitoren erkannt werden (Behrens und Meyerhof, 2013). Antagonisten des Bittergeschmacks konnten nicht nur dazu beitragen die Verbraucherakzeptanz von gesunden Lebensmitteln und Medikamenten zu erhohen, sondern auch als mechanistische Werkzeuge zum gezielten Ausschalten einzelner oder Teilgruppen von TAS2Rs zur weiterer Aufklarung der Bittergeschmackswahrnehmung eingesetzt werden.
Among the five basic taste qualities, bitter taste is believed to protect from the ingestion of potentially toxic substances (Lindemann, 1996). In humans, about 25 functional bitter taste receptors (TAS2R) exist, which belong to the family of G protein-coupled receptors (Chandrashekar et al., 2010). In a previous study, two bitter substances were identified that are, on the one hand, TAS2R agonists and, on the other hand, are able to inhibit a different subset of bitter taste receptors. The occurrence of TAS2R antagonists in the same plant species that produces bitter agonists indicates that bitter taste perception is even more complex as previously believed (Brockhoff et al. 2011). The identification of these bitter antagonists raised the question of how widespread this phenomenon is. Using heterologous expression of TAS2Rs in HEK 293T cells stably expressing the G-protein chimera Gα16gust44, the receptor response can be monitored via functional calcium imaging. In order to identify substances inhibiting TAS2Rs, calcium signals of the agonist applied alone to the cells compared to the application of the agonist premixed with test substance were analysed. In total 52 bitter substances were screened on eight TAS2Rs (TAS2R9, -R10, -R14, -R16, - R38, -R43, -R46, -R50) with different tuning breadths. 20 substances were identified to be antagonists. Eight of these showed an inhibitory effect for two or more TAS2Rs. Strikingly, three compounds (Allylisothiocyanat, Chloroquin and Phenanthrolin) reduced the calcium signals of six or more TAS2Rs. By means of dose response experiments I demonstrated that Chloroquin (on TAS2R16 and -R38) and Phenanthrolin (on TAS2R10 and -R46) act as insurmountable antagonists. Strikingly, for TAS2R50 with three known agonists by far the most antagonists were identified. Furthermore, the substance Hardwickic acid (FL101237) was tested for all 21 deorphanized TAS2Rs. FL101237 showed inhibitory effects on 19 TAS2Rs and even fully blocked the signal response for 11. In addition, FL101237 activated the TAS2R1 and acted as partial agonist on TAS2R46. By examining TAS2Rs with different tuning breadths I observed that the number of presumed ligands, consisting of agonists and inhibitors, might be more similar than previously anticipated. In general, an obvious structural similarity among agonists and antagonist of the same receptor was not observed. Moreover, it can be concluded that bitter compounds frequently represent agonists and antagonists of different subsets of TAS2Rs, substantiating the notion that the overlapping spectra of activating and inhibiting substances of TAS2Rs is elevating the known complexity of bitter taste perception even further. In the future antagonists could be useful tools for examining the perception of bitter substances and to inhibit the bitter off-taste of healthy food and drugs.
