Metal Centers in [NiFe] and [FeFe] Hydrogenase Proteins and Synthetic Model Complexes Studied by X-ray Spectroscopy Techniques

Abstract

Hydrogenases catalyze reversible H2-turnover and are of prime interest for renewable energy applications. Important questions address the reaction cycle mechanisms and the unusual O2-tolerance of certain hydrogenases. Achieving O2-tolerance also in synthetic catalysts would be a major step towards a hydrogen economy. The main task was the comparison of molecular and electronic structures of metal cofactors in O2-tolerant and O2-inhibited [NiFe] hydrogenases and in an irreversibly O2-deactivated [FeFe] hydrogenase using XAS. The primary goal was the characterization of differences at their metal cofactors. Comparative Ni- and Fe-XAS studies on O2-tolerant membrane-bound (MBH) and O2-sensitive periplasmic (PH) [NiFe] hydrogenases from six organisms have revealed globally similar coordination of the nickel, but also altered locations of reduced O-species at the [NiFe] cofactor in the MBHs. A highlight was the detection of altered structures of FeS clusters in the MBHs, assigned to an unusual 3+1 arrangement of iron in the proximal cluster, as confirmed by MBH crystal structures disclosing a unique [4Fe3S] proximal cluster. XAS showed that cysteine ligand mutation can revert the [4Fe3S] to a normal [4Fe4S] cluster. The [4Fe3S] cluster and altered O2-handling at the active site may provide O2-tolerance in the MBHs. Regulatory [NiFe] hydrogenases (RH) are complex O2-tolerant H2-sensors. XAS on the RH from R. eutropha has revealed considerable plasticity at the [NiFe] site with respect to oxidative modifications and altered FeS clusters undergoing EPR-silent redox transitions. In a truncated RH construct one FeS cluster is lost. The data suggest unusual structural and redox FeS cluster properties in the RH, but a rather standard [NiFe] site. Soluble [NiFe] hydrogenases (SH) catalyze reversible H2-turnover. A minimal active construct of the R. eutropha SH was studied by XAS, which has revealed a single [4Fe4S] cluster in the HoxY subunit. Experimentally demanding high-resolution XAS and XES methods, e.g., resonant inelastic X-ray scattering (RIXS), facilitate electronic structure determination. First Ni RIXS experiments were carried out and revealed the applicability to dilute protein samples and the superior resolution of electronic transitions. The [FeFe] hydrogenase HydA1 from green algae is the most active H2-producer in nature. Its active site (H-cluster) consists of a [4Fe4S]H cluster connected to a diiron unit, 2FeH. Extended-range Fe-XAS on HydA1 from C. reinhardtii facilitated determination of bond-lengths and Fe-Fe distances individually for the two subcomplexes and structural changes upon exposure to O2 or CO. In conclusion, extensive XAS studies were conducted on various O2-tolerant and O2-sensitive [NiFe] and [FeFe] hydrogenases from different organisms. They have provided deeper insight into the metal cofactor structures and possible reasons for their unusual catalytic behavior. Advanced X-ray spectroscopy methods were further developed.

Hydrogenasen katalysieren die reversible H2-Bildung und sind von besonderem Interesse für erneuerbare Energie Anwendungen. Offene Fragen bestehen zu Reaktionsmechanismen und der ungewöhnlichen O2-Toleranz der H2-Katalyse macher Hydrogenasen, welche ein wichtiger Faktor für eine künftige H2-Ökonomie ist. Aufgabe war die vergleichende Untersuchung der molekularen und elektronischen Struktur von Metall-Kofaktoren in O2-toleranten und O2-inhibierten [NiFe] Hydrogenasen und in einer O2-deaktivierten [FeFe] Hydrogenase mittels XAS zur Herausarbeitung funktionell relevanter Unterschiede. Vergleichende Ni- und Fe- XAS Untersuchungen an O2-toleranten Membran-gebundenen (MBH) und O2-sensitiven periplasmatischen (PH) [NiFe] Hydrogenasen aus sechs Organismen zeigten ähnliche Ni Bindestellen aber eine veränderte Anordnung von O-Spezies am [NiFe] Kofaktor in den MBHs. Besonders interessant war die Detektion von veränderten FeS Cluster Strukturen in den MBHs, interpretiert als 3+1 Anordnung der Fe Atome im proximalen Cluster, was in MBH Kristallen, die einen neuen proximalen [4Fe3S] Cluster zeigen, bestätigt wird. XAS hat gezeigt, dass der [4Fe3S] Cluster durch Mutagenese in einen [4Fe4S] Cluster konvertiert wird. Der [4Fe3S] Cluster und eine veränderte O2-Chemie könnten synergetisch die O2-Toleranz der MBHs verantworten. Regulatorische [NiFe] Hydrogenasen (RH) sind komplexe O2-tolerante H2-Sensoren. XAS an der RH aus R. eutropha zeigte die Plastizität des [NiFe] Kofaktors für oxidative Modifikation und veränderte FeS Cluster mit EPR-unsichtbaren Redox-Übergängen. In einem verkürzten RH Konstrukt geht ein FeS Cluster verloren. Die Daten zeigen ungewöhnliche Eigenschaften der FeS Cluster und einen normalen [NiFe] Kofaktor. Lösliche [NiFe] Hydrogenasen (SH) sind reversible H2-Bildner. XAS an einem aktiven Minimalkonstrukt der SH aus R. eutropha zeigte einen einzigen [4Fe4S] Cluster in der HoxY Untereinheit. Anspruchsvolle hochauflösende XAS und XES Methoden wie resonante inelastische Röntgenstreuung (RIXS) dienen der elektronischen Strukturbestimmung. Erste Ni RIXS Experimente belegten die Anwendbarkeit der Methode auf verdünnte Proteinproben und die gute Auflösung elektronischer Übergänge. Die [FeFe] Hydrogenase HydA1 aus Grünalgen ist der aktivste H2-Produzent in der Natur. Das aktive Zentrum (H-cluster) besteht aus einem [4Fe4S]H Cluster, der an ein Zweieisen-Zentrum (2FeH) bindet. Fe-XAS mit besonders hohen Anregungsenergien an HydA1 aus C. reinhardtii erlaubte die Bestimmung von individuellen Bindungslängen und Metallabständen in den beiden Subkomplexen und die Detektion von Änderungen unter O2 oder CO. Umfangreiche XAS Studien wurden an O2-toleranten und O2-sensitiven [NiFe] und [FeFe] Hydrogenasen aus mehreren Organismen durchgeführt, die vertiefte Einblicke in die Strukturen der Metall-Kofaktoren und mögliche Gründe für die ungewöhnlichen katalytischen Eigenschaften geliefert haben. Fortgeschrittene Röntgenmethoden wurden weiterentwickelt.