Untersuchungen der strukturellen und funktionellen Konsequenzen einer Mutation im Myomesin-Gen

Abstract

Myomesin, ein 185 kDa großes Protein, das aus 13 Immunglobin- und Fibronektin- Domänen besteht, spielt eine wichtige Rolle für die Struktur und Funktion der M-Bande des Sarkomers aller höherer Vertebraten. Die C-terminale Myomesindomäne 13 bildet antiparallele Dimere, welche die benachbarten Myosinfilamente sowie Titin in der M-Bande quer vernetzen. Diese Interaktionen dienen der Stabilisierung des kontraktilen Apparates während der Muskelkontraktion. In einer früheren Arbeit wurde bei einer Familie mit hypertropher Kardiomyopathie (HCM) eine Mutation in der Myomesindomäne 12 identifiziert, bei der Valin durch Isoleucin an der Aminosäureposition 1490 ersetzt wird (V1490I). Um den Effekt der Mutation V1490I auf die Struktur und Funktion der Myomesindomänen My11-13, My11-12 und My12-13 zu untersuchen, wurden in meiner vorliegenden Arbeit Analytische Ultrazentrifugation, Zirkulardichroismus, Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Analyse sowie ein „Sarcomeric Sorting Assay“ der entsprechenden Myomesinfragmente durchgeführt. Sowohl die Wildtypfragmente (WT) als auch die mutierten Myomesinfragmente (V1490I) lagen bei Konzentrationen bis zu 10 μM als stabile Dimere vor. Der „Sarcomeric Sorting Assay“ in neonatalen Kardiomyozyten zeigte, dass sich die normalen und mutierten rekombinanten Myomesinfragmente in die M-Bande integrieren. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, dass die rekombinanten Myomesinfragmente die strukturellen und funktionellen Eigenschaften nativen Myomesins besaßen. Die mutierten Myomesinfragmente wiesen dabei jedoch andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften auf als die entsprechenden Wildtypfragmente. Die mutierten Myomesindimere My11-13V1490I und My12-13V1490I besaßen eine geringere Thermostabilität als die Wildtypen My11-13WT und My12-13WT. Das Myomesinmonomer My11-12V1490I, bei dem die Dimerisierungsdomäne 13 fehlte, wies dagegen keinen Unterschied zum Wildtyp My11-12WT auf. Tatsächlich waren die Bindungssaffinitäten von My 11-13V1490I und My12-13V1490I signifikant verändert. Beide Ergebnisse belegten eine Störung der Myomesindimerisierung über Domäne 13. Neben der anormalen Dimerisierung verursachte die V1490I Mutation weitere Funktionsveränderungen. Konzentrationen ab 10 μM führten zur Aggregation von My11-13V1490I, während My11-13WT weiterhin als stabiles Dimer vorlag. In neonatalen Kardiomyozyten zeigte My11-13V1490I einen verzögerten Einbau in die M-Bande der Sarkomere. Die anormale Dimerisierung, Multimerisierung sowie der verzögerte Einbau in die M-Bande von mutiertem Myomesin (V1490) könnte die Sarkomerstabilität beinträchtigen und schließlich zur Entstehung der hypertrophen Kardiomyopathie (HCM) beitragen.

Myomesin is a 185 kDa protein and consists of 13 immunoglobulin-like and fibronectin type III domains. It plays an important structural and functional role in the M-band of striated muscles of all higher vertebrates. The C-terminal myomesin domain 13 dimerises and forms antiparallel strands which cross-link neighboring myosin filaments and titin in the M-line of the sarcomere. These interactions stabilise the contractile apparatus during striated muscle contraction. In a previous study a missense mutation in the myomesin domain 12 was identified in a family with inherited hypertrophic cardiomyopathy (HCM), in which valine at amino acid position 1490 was substituted by isoleucine. Analytical ultracentrifugation experiments, circular dichroism spectroscopy, Surface Plasmon Resonance studies and a sarcomeric sorting assay in neonatal cardiomyocytes of myomesin fragments were carried out in this study to investigate the effects of the mutation V1490I on structure and function of myomesin domains My11-13, My11-12 and My12-13. Both the wild type and mutated myomesin domains My11-13 formed stable dimers at concentrations below 10 μM. The sarcomeric sorting assay showed that normal and mutated myomesin fragments My11-13 integrated in the M-band of the sarcomere, confirming that the recombinant myomesin fragments had comparable structural and functional properties of native myomesin. But mutated myomesin fragments showed different structural and functional properties than the corresponding wild type proteins. Mutated myomesin dimers My11-13V1490I and My12-13V1490I revealed a reduced thermal stability. However, monomeric myomesin fragment My11-12, i.e. without dimerisation domain 13 showed no difference in thermal stability between wild type and V1490I mutated myomesin. In fact binding affinities of My11-13V1490I and My12-13V1490I changed significantly. Both results allocated disturbance of myomesin dimerisation via domain 13. In addition to abnormal dimerisation mutation V1490I caused further functional changes. Concentrations above 10 μM led to aggregation of mutated myomesin My11-13V1490I, while wild type My11-13 formed stable dimers. In neonatal cardiomyocytes My11-13V1490I showed decelerated incorporation into the M-band of the sarcomere. In conclusion, the abnormal dimerisation, multimerisation and M-band incorporation of mutated myomesin may affect proper sarcomere stability and thereby may contribute to the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy (HCM).