Biochemische Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus antitumoraktiver Cobalt- Alkin-Komplexe

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden physikochemische und biochemische Eigenschaften antitumoraktiver Cobalt-Alkin-Komplexe, sowie das Verhalten dieser Verbindungen unter Zellkulturbedingungen untersucht. Die Versuche wurden im Hinblick auf eine Aufklärung des bisher unbekannten Wirkungsmechanismus dieser Substanzklasse durchgeführt. Im Zentrum der Arbeit steht die aus den Vorarbeiten bekannte Leitstruktur Co-ASS. Sämtliche Experimente wurden mit dieser Substanz vorgenommen und durch Versuche mit Komplexen unterschiedlicher cytotoxischer Aktivität ergänzt. Dadurch sollten die Eigenschaften, die aussschlaggebend für die biologische Aktivität sind, festgestellt werden. Um zu erfassen, in welchem Ausmaß unterschiedliche Lipohilie und Zellanreicherung in Zusammenhang mit der Wirksamkeit stehen, wurde der logkw-Wert mit einer HPLC-Methode und die Zellaufnahme an verschiedenen Zellkulturen durch Atomabsorptionsspektroskopie ermittelt. Die Daten wurden mit den jeweiligen IC50-Werten verglichen. Dabei ist festzustellen, dass zwischen adhärent wachsenden Zellen und Suspensionszellkulturen wesentliche Unterschiede bestehen. Bei den adhärent wachsenden MCF-7 und MDA-MB-231 Brustkrebszellen wurden wesentlich höhere intrazelluläre Substanzkonzentrationen ermittelt als bei in Suspension kultivierten Leukämie- und Lymphomzellen. Die höhere Zellaufnahme geht dabei einher mit niedrigeren IC50-Werten. Innerhalb der untersuchten Zellkulturen kann jedoch keine Korrelation zwischen Substanzwirkung und Zellaufnahme festgestellt werden. Ebenso wird deutlich, dass die Konzentration in den Zellen nicht von der Lipohilie der Substanzen allein bestimmt wird. Bei Gegenüberstellung der IC50-Werte und der logkw-Werte kann ein mathematischer Zusammenhang erkannt werden - allerdings nur unter Nichtber"ucksichtigung der wirksamsten Verbindung Co-ASS. Diese Ergebnisse sind als starkes Indiz für das Vorliegen eines spezifischen, nicht von pharmakodynamischen Parametern allein bestimmten, Wirkungsmechanismus zu werten. Untersuchungen zur Reaktivität der Komplexe beinhalteten Protein- und DNS-Bindungsstudien, sowie die Interaktion mit Thiolen. Sowohl die Bindung an Humanserumalbumin und an die DNS kann beträchtliche Ausmaße annehmen. Dies legt ein hohes Reaktionsvermögen mit Biomolekülen nahe. Thiole, wie z.B. das Tripeptid Glutathion, reagierten unter Disulfidbrückenbildung. Aufbauend auf diese Ergebnisse, wurde das Vermögen der Komplexe in die Zellkerne zu gelangen und das Enzym Glutathionreduktase zu hemmen bestimmt. Dabei zeigte sich, dass nur wenige Prozent der in die Zellen aufgenommenen Substanzmenge in den Nuclei wiedergefunden werden. Folglich kann ein Wirkungsmechanismus basierend auf Interaktion mit der DNS praktisch ausgeschloßen werden. Zellkulturversuche an MCF-7 zeigten, dass das Enzym Glutathionreduktase durch die Verbindungen nicht in seiner Aktivität beeinflußt wird. Aufgrund der Acetylsalicylsäureteilstruktur von Co-ASS und dem Vermögen von NSAR das Wachstum von Tumoren zu verringern, wurde die Hemmwirksamkeit der Verbindungen an Cyclooxygenasen (COX-1 und COX-2) untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass Co-ASS ein wesentlich potenterer Hemmstoff beider Isoenzyme ist als die 'Ausgangsverbindung' Acetylsalicylsäure (Aspirin). Die Hemmwirksamkeit weiterer untersuchter strukturell verwandter Komplexe war deutlich geringer, einhergehend mit höheren IC50-Werten. Bezugnehmend auf diese Ergebnisse, wurden die Cytotoxizitätsuntersuchungen auf COX-2-überexprimierende HT-29 Kolonkarzinomzellen ausgedehnt. Dabei zeigte sich, dass Co-ASS an diesen Zellen zu Cisplatin und 5-Fluorouracil vergleichbare Aktivität zeigt. Schlußfolgernd kann festgestellt werden, dass die antiproliferative Wirksamkeit der Komplexe nur begrenzt auf unterschiedliche Aufnahme in die Zellen oder Interaktion mit der DNS zurückgeführt werden kann. Die Antitumoraktivität steht vielmehr mit dem Vermögen dieser Verbindungen, Cyclooxygenasen zu hemmen, in Zusammenhang. Diese Enzyme werden als Zielstrukturen einer zukünftigen Therapie einer Vielzahl humaner Tumoren gesehen.

This thesis deals with the biochemistry and physicochemistry of antitumor- active cobalt-alkyne complexes as well as their properties under in-vitro conditions. The purpose of the experiments was to study the unknown mode of drug action of this class of substances. Experiments were done on the lead compound Co-ASS and structurally related less active drugs. Thus, properties responsible for the pharmacological profile of the complexes should be discovered. The lipophilicity of the complexes was determined as logkw-value by HPLC and the cellular uptake was quantified by graphite furnace atomic absorption spectroscopy. The cytotoxicity was measured as IC50-value. Comparative studies revealed that adherent growing MCF-7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells were more sensitive to the cytotoxic action than leukemia and lymphoma cells cultured in suspension. This correlated with a lower cellular uptake in lymphoma and leukemia cells compared to the breast cancer cells. The intracellular concentration could neither be directly correlated to the lipophilicity nor to the cytotoxic activity. Mathematical functions could be estimated by correlating the IC50- with the logkw-value, but only if Co-ASS was excluded from the calculations. Therefore, a specific mode of drug action had to be taken into account for this compound. DNA- and protein-binding studies showed that cobalt-alkyne complexes can react readily with biomolecules. The reaction with thiols resulted in disulfide-bond formation. Based on these results the nuclei of the cells were investigated for their cobalt content and the compounds were examined for their ability to inhibit the enzyme glutathione reductase. The enzymatic activity of glutathione reductase was not influenced and the cobalt amounts recovered from the nuclear lysates were comparably low. Therefore, the inhibition of glutathione reductase as well as a genomic mode of drug action could be excluded. The lead compound Co-ASS contains an acetylsalicylic acid substructure. As nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are considered as cytostatics of the future, studies on the ability of the cobalt-alkyne complexes to inhibit the target enzymes of the NSAIDs were performed. ELISA experiments on cyclooxygenase enzymes (COX-1 and COX-2) showed that Co-ASS is a potent inhibitor of both COX-1 and COX-2 and is by far more active than the 'parent' compound aspirin. Other structurally related cobalt-alkyne complexes were weaker enzyme inhibitors, correlating with higher IC50-values in cytotoxicity experiments. Further cytotoxicity studies on COX-2 overexpressing HT-29 human colon carcinoma cells revealed that Co-ASS is nearly as potent as Cisplatin or 5-FU at these cells. In conclusion it can be stated that the antitumor activity of cobalt-alkyne complexes can neither be correlated to different cellular uptake nor to interaction with the DNA. The cytotoxic activity depends on the inhibition of cyclooxygenase enzymes.