Die Huntington-Krankheit (HK) ist eine progressive, autosomal-dominant vererbte neurodegenerative Erkrankung, die sich mit motorischen, kognitiven und psychiatrischen Symptomen manifestiert. Die HK ist bis heute unheilbar und wird durch die Expansion des CAG-Trinukleotid-Repeats im HTT-Gen verursacht. Diese hat eine Verlängerung der Polyglutamin-Sequenz im Huntingtin-Protein (HTT) zur Folge, wodurch die Konformation des Proteins instabil wird und es zur Bildung von amyloidogenen Proteinaggregaten kommt, die hauptsächlich aus N-terminalen HTT Fragmenten bestehen. Amyloidogene Aggregate des mutierten HTT (mHTT) weisen gemeinsame Merkmale mit Prionen auf, da sie in der Lage sind, ihre fehlgefaltete Struktur auf nativ gefaltetes mHTT zu übertragen und sich zwischen benachbarten Zellen auszubreiten. Die Bedeutung von mHTT-Aggregaten und deren prionenähnlichen Eigenschaften für die Pathogenese der HK ist jedoch nur wenig erforscht. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich einen FRET-basierten HTT-Seeding-Assay (FRASE) zum Nachweis selbstreplizierender mHTT-Aggregate („seeds“) entwickelt und ihn für den sensitiven Nachweis der Replikationsaktivität (HSA) in biologischen Proben von Patienten mit der HK und Modellsystemen optimiert. mHTT „seeds“ konnten früh im Krankheitsverlauf nachgewiesen werden und nahmen in ihrer Häufigkeit zu, was darauf hindeutet, dass durch die Messung der HSA das Fortschreiten der Krankheit quantitativ verfolgt werden kann. Biochemische Untersuchungen von Maushirnhomogenaten zeigten, dass eher kleine als große mHTT-Aggregatspezies für die gemessene HSA verantwortlich sind. Mit dem FRASE-Assay untersuchte ich HSA in einem etablierten induzierbaren Drosophila-HD-Modell und beobachtete eine starke Korrelation zwischen HSA und erhöhter Mortalität in transgenen Fliegen, was nahelegt, dass mHTT „seeds“ krankheitsrelevante neurotoxische Strukturen sind. Mittels strukturgestützter Mutagenese habe ich anschließend Proteinvarianten des mHTTex1 Proteins generiert, um die Auswirkungen der Struktur von mHTTex-Aggregaten auf deren Toxizität zu untersuchen. Die generierten mHTTex1-Proteinvarianten unterschieden sich in ihren Aggregationseigenschaften und bildeten fibrilläre Aggregate mit unterschiedlicher Stabilität und Morphologie. Um die Proteotoxizität von strukturell unterschiedlichen mHTTex1 Aggregaten in vivo zu untersuchen, wurden die Proteinvarianten in neu entwickelten Drosophila-Modellen panneuronal exprimiert. Die phänotypische und biochemische Charakterisierung der transgenen Fliegen zeigte, dass die Aggregatbildung mit der Toxizität korreliert und dass diese auch von der Stabilität der Aggregate beeinflusst wird. Zusammengefasst weisen meine Studien darauf hin, dass selbstreplizierenden mHTTex1-Aggregate bei der Pathogenese der HK eine wichtige Rolle spielen. Außerdem entwickelte ich eine Vielzahl neuer Methoden und Werkzeuge, die nun in der Krankheitsforschung angewendet werden können.
Huntington’s disease (HD) is progressive neurodegenerative disorder with an autosomal dominant inheritance, manifesting with a triad of motor, cognitive and behavioral symptoms. HD is an incurable disease caused by a CAG trinucleotide repeat expansion in the HTT gene, which translates into an expanded polyglutamine tract in the huntingtin (HTT) protein. This expansion renders the conformation of the HTT protein unstable and promotes the assembly of amyloidogenic protein aggregates, predominantly composed of N-terminal HTT fragments. Amyloidogenic mutant HTT (mHTT) aggregates share common features with prion proteins, being able to self-propagate their corrupted conformation and to spread between adjacent cells. However, the role of mHTT aggregates and their prion-like features in the pathogenesis of HD remains elusive. To address this question, I developed a FRET-based aggregate HTT seeding assay (FRASE) for the detection of self-replicating mHTT aggregates. I optimized the assay for the sensitive quantification of mHTT seeding activity (HSA) in biological samples from HD patients and disease models. I could show that mHTT seeds are present early in the pathogenesis and increase in abundance with progression of disease, suggesting that HSA quantitatively tracks disease progression. Biochemical investigations of mouse brain homogenates demonstrated that small, rather than large, mHTT structures are responsible for the HSA measured in FRASE assays. Using the FRASE assay, I assessed HSA in an established inducible Drosophila model of HD and found a strong correlation between HSA and increased mortality in transgenic HD flies, suggesting that self-replicating mHTT seeds are disease relevant, neurotoxic structures causing severe phenotypic consequences in vivo. Next, I used structure-guided mutagenesis to generate protein variants of the N-terminal mHTT exon 1 fragment (mHTTex1), as a tool to explore the relationship between the structural properties of mHTTex1 aggregates and their putative proteotoxicity. Recombinant mHTTex1 protein variants were distinct in their aggregation properties and revealed fibrillar aggregates with different stabilities and morphologies. In order to relate these structural features to mHTTex1-induced proteotoxicity, protein variants were pan-neuronally expressed in a newly developed Drosophila model. Behavioral and biochemical analysis of transgenic flies confirmed the concurrence of mHTTex1 aggregates and toxicity and indicated that aggregate stability influences neurotoxicity in transgenic HD flies. Taken together, my studies emphasize the importance of self-replicating mHTTex1 aggregates in HD pathogenesis and provide novel tools for basic and clinical disease research.
