Reinigung und Charakterisierung von alpha-1,3-Gal spezifischen Antikörpern

Abstract

Das α-Gal Epitop ist ein immunogenes Glykan-Epitop, das aus der Trisaccharidstruktur GlcNAc-β-1,4-Gal-α-1,3-Gal besteht. Es kann als Anteil komplexer N-Glykane auf Glykoproteinen oder als Lipid-verknüpftes Glykokonjugat auf Zelloberflächen von Nicht Primaten wie Neuweltaffen, Schweinen und Kaninchen präsentiert werden. Menschen und Altweltaffen exprimieren das α-Gal Epitop aufgrund der evolutionär bedingten Inaktivierung der α-1,3-Galaktosyltransferase nicht. Antikörper gegen das α-Gal Epitop werden als Immunantwort gegen Darmbakterien produziert, die α-Gal Strukturen auf ihrer Lipopolysaccharidschicht tragen. Es ist bekannt, dass α-Gal tragende Proteine zu Abstoßungsreaktionen und Anaphylaxie in Primaten führen. Obwohl viele geschichtliche Fakten und Eigenschaften des α-Gal Epitops bekannt sind, existiert nur wenig Wissen betrefflich der Charakteristiken von anti-Gal Antikörpern im Menschen. Darum wurden anti Gal Antikörper in dieser Arbeit erstmalig aus Octagam gereinigt und hinsichtlich ihrer Spezifität gegenüber dem α Gal Epitop, der Verteilung von IgG Subklassen, ihrem isoelektrischen Punkt und ihrer N Glykosylierung untersucht. Die bislang nur mit wenigen Methoden gezeigte Spezifität von anti-Gal Antikörpern zum α Gal Epitop wurde in meiner Arbeit durch verschiedene orthogonale Methoden, darunter ELISA, Erythrozytenagglutination, Oberflächenplasmonresonanz und Western Blot, in bisher nicht vorhanden gewesener Detailliertheit und Tiefe nachgewiesen. Neben dem erfolgreichen Nachweis der Antikörperspezifität wurden erstmalig bedeutende anti-Gal Charakteristika wie die Distribution von IgG Subklassen, das isoelektrische Verhalten und die N Glykosylierung analysiert. Gereinigte und spezifische anti-Gal Antikörper bestanden hauptsächlich aus dem IgG2 Isotyp (83%). Anti Gal Antikörper zeigten human-IgG ähnliches Verhalten sowie eine human-IgG ähnliche Glykosylierung, dominiert von biantennären und fukosylierten N Glykanstrukturen. Die Verwendung der gereinigten Antikörper als Werkzeug für die Detektion von α-Gal Strukturen auf Cetuximab, bovinem Thyroglobulinen und rekombinantem Faktor VIII wurde innerhalb dieser Arbeit untersucht und das gewonnene Wissen über verschiedene Charakteristika der anti-Gal Antikörper wurde in einen Zusammenhang mit im humanen Organismus ablaufenden Immunreaktionen gestellt. Die Experimente und Versuche dieser Arbeit gaben einen zuvor noch nicht existenten Einblick in Eigenschaften und Charakteristika isolierter anti Gal Antikörper und zeigten mögliche Verwendungen gereiniger anti-Gal Antikörper zur Detektion des α-Gal Epitops auf.

The α-Gal epitope is an immunogenic glycan epitope which consists of the trisaccharide structure GlcNAc-β-1,4-Gal-α-1,3-Gal. It can be presented as part of complex type N-glycans on glycoproteins or as lipid-linked glycan conjugate on cell surfaces of non-primate mammalians like new world monkeys, pigs and rabbits. Humans and old world monkeys do not express the α-Gal epitope due to the evolutionary inactivation of the α-1,3-galactosyltransferase which is the catalyzing enzyme for its synthesis. Antibodies against the α-Gal epitope are produced naturally as immunological response to intestinal bacteria that bear α-Gal structures on their lipopolysaccharide chains. It is common knowledge that α-Gal bearing proteins lead to hyperacute rejection and anaphylaxis in primate organisms. Although much about α-Gal and its background is already known, only little knowledge exists concerning the characteristics of anti-Gal antibodies in human. Therefore, for the first time, anti-Gal antibodies were purified from Octagam and characterized in terms of specificity towards the α-Gal epitope, IgG subclass distribution, isoelectric behaviour and glycosylation. The specificity of anti-Gal antibodies to the α Gal epitope, which so far has been shown only with a few methods, has been investigated in my work by various orthogonal methods including ELISA, erythrocyte agglutination, SPR and Western Blot. In addition to the successful detection of antibody specificity, significant anti-Gal characteristics such as distribution of IgG subclasses, isoelectric behavior, and N glycosylation were analyzed for the first time. Purified anti-Gal antibodies consisted mainly of the IgG2 isotype (83%). Anti-Gal showed human IgG like isoelectric behaviour as well as a typical human IgG-like N-glycosylation profile dominated by biantennary, fucosylated N-glycan structures. The usage of these purified antibodies as a tool for the detection of α-Gal structures on Cetuximab, bovine Thyroglobuline and recombinant Factor VIII is investigated and discussed within this work. The gained knowledge about the characteristics of the anti-Gal antibody was linked to immune reactions occurring in the human body for the first time. The experiments and investigations carried out in this work gave a previously non-existent insight into the properties and characteristics of isolated anti-Gal antibodies and discovered the suitability of the purified anti Gal antibody as detection antibody for the α-Gal epitope.