The structure and function of proteins depend on the protonation states of amino acids; ergo, the pKa values of titratable residues in proteins and the influence of protein environment on these pKa values are of great interest in biochemistry. In this work, the method for pKa computations is improved. More importantly, electrostatic energy and pKa computations are used to shed light on the function of a prominent enzyme in energy metabolism, namely cytochrome c oxidase. Karlsberg2+ is a modular software used for pKa computations of proteins with known structure, using an implementation of the established protocol from its preceding version. The pKa values are obtained by solving the linearized Poisson-Boltzmann equation. To adapt the protein conformation to different pH ranges, local conformational changes are modeled, i.e. salt-bridges are perturbed. The slow modeling procedure from the software predecessor is improved, accelerating the computation 16 times on the average. The software was tested on the extensive benchmark set of 194 experimental pKa values, however, computation accuracy remains unchanged. The important elements of cytochrome c oxidase (CcO) function are elucidated. CcO is a terminal enzyme of the electron transport chain in mitochondria and some aerobic bacteria. It is reducing the molecular oxygen and using the released energy to pump protons across the membrane against the electrochemical gradient. With each electron from cytochrome c, one proton is pumped and one is spent in the chemical reaction (chemical proton) at the binuclear center (BNC). In total, four pumped and two chemical protons are translocated via the D-channel and remaining two chemical protons via the K-channel. The proton loading site (PLS) is a molecular group whose pKa increases upon reduction of BNC and temporarily store a pumped proton. The arrival of the chemical proton in the BNC and possibly the next upcoming pumped proton lowers the pKa of the PLS, pumping proton to the other side of the membrane. The required difference in the pKa values should approximately be 5 pH units. In this study, potential PLS candidates are identified and studied. The propionates D- and A- of heme a3 (PRDa3 and PRAa3, respectively) can act as the PLS, when the salt-bridge, blocking the protonation of PRDa3, is open and when PRAa3 is not involved in hydrogen bonding. Coupled with charge changes at the BNC, the pKa change of PRDa3 is 2.24 and of PRAa3 is 1.36, suggesting that other changes in the environment of the PLS may take place in order to fully explain its function. Propionates of heme a are excluded as PLS candidates. Loading and unloading schemes of the PLS involving propionates of heme a3 and His ligand of CuB are postulated. K-channel is active in the reductive part of the CcO redox cycle. In this study, pioneering work, which combines molecular dynamics (MD) simulations and pKa computations with site-directed fluorescence labelling experiments, explains some aspects of the K-channel activity. His73 is proposed as the K-channel proton entry point, possibly serving as a proton shuttle. The direct electrostatic influence of redox changes at the BNC on pKa values of residues at the CcO surface close to the K-channel entry is marginal. As a consequence, it is implied that in the reductive part of the CcO cycle, subtle conformational changes take place, namely rearrangements of hydrogen-bond networks, possibly affecting some secondary structural elements.
Die Struktur und Funktion von Proteinen hängt von den Protonierungszuständen der Aminosäuren ab. Daher sind die pKa Werte von titrierbaren Residuen in Proteinen und der Einfluss der Proteinumgebung auf diese pKa Werte in der Biochemie von großem Interesse. In dieser Arbeit wird die Methode für pKa Berechnungen verbessert. Außerdem werden elektrostatische Energie und pKa-Berechnungen verwendet, um die Funktion eines wichtiges Enzyms im Energiestoffwechsel, nämlich der Cytochrom-c-Oxidase, zu untersuchen. Karlsberg2+ ist eine modulare Software, die für die pKa-Berechnung von Proteinen mit bekannter Struktur verwendet wird, wobei eine Implementierung aus der Vorgängerversion verwendet wird. Die pKa-Werte werden durch Lösen der linearisierten Poisson-Boltzmann-Gleichung erhalten. Um die Proteinkonformation an verschiedene pH-Bereiche anzupassen, werden lokale Konformationsänderungen modelliert, d. h. Salzbrücken werden geöffnet. Die CPU-intensive Modellierungsmethode des Softwarevorgängers wurde verbessert, wodurch die Berechnung von pKa Werten im Durchschnitt 16-fach beschleunigt wird. Die Software wurde mit dem umfangreichen Benchmark von 194 experimentellen pKa-Werten getestet. Die veränderte Methode liefert pKa-Werte mit derselben Genauigkeit. Die wichtigen Elemente der Funktion der Cytochrom-c-Oxidase (CcO) werden erläutert. CcO ist ein terminales Enzym der Elektronentransportkette in Mitochondrien und einigen aeroben Bakterien. Es reduziert den molekularen Sauerstoff und nutzt die freigesetzte Energie, um Protonen gegen den elektrochemischen Gradienten durch die Membran zu pumpen. Mit jedem Elektron aus Cytochrom c wird ein Proton gepumpt und eines in der chemischen Reaktion (chemisches Proton) am aktiven Zentrum (BNC) verbraucht. Insgesamt werden vier gepumpte und zwei chemische Protonen über den D-Kanal und die verbleibenden zwei chemischen Protonen über den K-Kanal transportiert. Die Protonenladungsstelle (PLS) ist eine molekulare Gruppe, deren pKa bei der Reduktion von BNC ansteigt und vorübergehend ein gepumptes Proton speichert. Das Eintreffen des chemischen Protons im BNC und möglicherweise des nächsten gepumpten Protons senkt den pKa Wert des PLS ab. Als Folge verlässt das Proton den PLS und wandert auf die andere Seite der Membran. Der dazu notwendige Unterschied in den pKa-Werten beträgt etwa 5 pH Einheiten. In dieser Studie werden potenzielle PLS-Kandidaten identifiziert und untersucht. Die Propionate D- und A- von Häm a3 (PRDa3 und PRAa3) können als PLS fungieren, wenn die Salzbrücke, die die Protonierung von PRDa3 blockiert, offen ist und PRAa3 nicht an der Wasserstoffbrückenbindung beteiligt ist. Zusammen mit den Ladungsänderungen am BNC ist die pKa-Änderung von PRDa3 2,24 und von PRAa3 1,36, was darauf hindeutet, dass weitere Änderungen in der Umgebung des PLS auftreten, um die Funktion der PLS vollständig zu erklären. Propionate von Häm a sind als PLS-Kandidaten ausgeschlossen. Das Laden und Entladen der PLS, an denen Propionate von Häm a3 und His-Ligand von CuB beteiligt sind, wird postuliert. Der K-Kanal ist im reduktiven Teil des CcO-Redox-Zyklus aktiv. In der vorliegenden Studie werden Molekulardynamik (MD) Simulationen und pKa-Berechnungen mit Experimenten zur gezielten Fluoreszenzmarkierung kombiniert und einige Aspekte der K-Kanal-Aktivität erläutert. His73 wird als K-Kanal-Proton-Eintrittspunkt vorgeschlagen, der möglicherweise als Proton-Shuttle dient. Der direkte elektrostatische Einfluss von Redoxänderungen am BNC auf die pKa-Werte von Residuen an der CcO-Oberfläche nahe dem K-Kanal-Eingang ist gering. Als Konsequenz wird impliziert, dass im reduktiven Teil des CcO-Zyklus subtile Konformationsänderungen stattfinden. Dies können Umlagerungen von Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerken sein, die möglicherweise auch sekundäre Strukturelemente betreffen.
