Das Ziel dieser Arbeit war die durchflusszytometrische Untersuchung der Fremdkörperantwort (FBR) nach Implantation von reinem Magnesium (Mg) im Vergleich zu den permanenten Biomaterialien Polyetheretherketon (PEEK) und Polystyrol (PS). Es sollte erstmals die FBR auf reines Magnesium im zeitlichen Verlauf beschrieben und detailliert dargestellt werden, wobei der Einfluss der In-vivo-Korrosion auf die lokale Immunantwort zu berücksichtigen war. Hierfür wurden die Aufarbeitung und die durchflusszytometrische Analyse der Fremdkörperkapsel im Tiermodell Ratte etabliert. Zusätzlich sollten systemische Effekte nach Implantation der Materialien mittels Durchflusszytometrie in Blut und Milz untersucht werden. In 108 weibliche Lewis Ratten wurden unter Allgemeinanästhesie jeweils vier zylindri-sche Implantate (Durchmesser 8 mm, Höhe 2 mm) eines Materials (PEEK, PS, Mg) nach einer präoperativen Blutentnahme implantiert. Dabei erhielt jedes Tier zwei subkutane und zwei intramuskuläre Implantate. Am 1., 3., 7., 14., 21. und 28. post-operativen Tag erfolgte unter erneuter Allgemeinanästhesie eine finale Blutentnahme mit anschließender Euthanasie der Tiere (n = 6 je Material und Zeitpunkt). Danach wurden die Milz sowie die Implantate mit der umgebenden Fremdkörperkapsel entnommen. Zusätzlich wurden Gewebeproben aus der unmittelbaren Umgebung der Fremdkörperkapseln zum Ausschluss einer bakteriellen Kontamination mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RTQ-PCR) asserviert. Für die durchflusszytometrische Untersuchung wurden aus Milz, Fremdkörperkapsel sowie den präoperativen und finalen Blutproben vitale Einzelzellsuspensionen gewonnen und mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern gefärbt. Es wurde jeweils ein spezifisches Antikörper-Panel für Blut/Milz und Fremdkörperkapsel etabliert und verwendet. Die Validierung der durchflusszytometrischen Analyse erfolgte mittels Zellsortierung, Zytozentrifugation und histologischer Färbung. Für die Mg-Implantate wurde nach Entfernen der Korrosionsprodukte die In-vivo-Korrosionsgeschwindigkeit anhand des Masseverlustes bestimmt. Die statistische Analyse der Zeitpunkt- und Materialgrup-penvergleiche in Blut, Milz und Fremdkörperkapsel umfasste eine zweifaktorielle Varianzanalyse, paarweise Vergleiche und eine Bonferroni-Holm-Prozedur. Mithilfe der etablierten durchflusszytometrischen Analyse konnten die charakteristischen Leukozytenpopulationen der FBR in der Fremdkörperkapsel identifiziert und quantifiziert werden. Es zeigte sich der typische zeitliche Verlauf der FBR für alle drei Biomaterialien mit einer initialen Dominanz von neutrophilen Granulozyten begleitet von einer zunehmenden Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen in die Implantatumgebung. Während der chronischen Entzündungsreaktion und der Fremdkörperreaktion dominierten ein- und mehrkernige Makrophagen sowie T-Lymphozyten in der Fremdkörperkapsel. Signifikante Unterschiede zwischen Mg und den permanenten Polymeren wurden ausschließlich nach subkutaner Implantation und nur für folgende Zellpopulationen aufgefunden: erhöhter Anteil der CD4-negativen Monozyten/Makrophagen an der Gesamtleukozytenzahl (Tag 1 und 3), erhöhter Anteil der Mastzellen/NK-Zellen an den lebenden Leukozyten (Tag 7 und 14) sowie verringerter Anteil der späten ein- und mehrkernigen Makrophagen an der Gesamtleukozytenzahl (Tag 14 und 28). Die analysierten Zellpopulationen in den finalen Blutproben befanden sich nach Implantation von PEEK, PS und Mg über den gesamten Untersuchungszeitraum jeweils innerhalb des studieninternen Referenzbereiches (präoperative Blutproben). Die Materialgruppenvergleiche der Blutproben ergaben keine Unterschiede. In der Milz zeigten sich für die untersuchten Leukozytenpopulationen keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Zeitpunkten und den Implantatmaterialien. Während der ersten vier Wochen nach Implantation korrodierte Mg in vivo mit einer niedrigen Korrosionsgeschwindigkeit begleitet von einer klinisch nicht relevanten Gasansammlung an der Implantationsstelle. Eine bakterielle Kontamination der Kapselproben wurde durch die RTQ-PCR ausgeschlossen. Zusammenfassend riefen die drei Implantatmaterialien PEEK, PS und Mg eine ver-gleichbare, milde lokale Immunantwort im untersuchten Zeitraum an beiden Implantat-lokalisationen hervor. Die subkutan aufgefundenen materialspezifischen Effekte der Mg-Implantate besaßen nur eine geringe Relevanz. Eine systemische Immunantwort infolge der Implantation konnte ausgeschlossen werden. Folglich hatte die In-vivo- Korrosion der Mg-Implantate im Vergleich zu PEEK und PS keinen verstärkenden Einfluss auf die FBR und verursachte keine systemische Immunantwort. Insgesamt legte die durchflusszytometrische Beurteilung der lokalen und systemischen Effekte nach Implantation eine gute Biokompatibilität von PEEK, PS und Mg nahe. Hierbei stellte die etablierte durchflusszytometrische Analyse ein geeignetes Werkzeug zur Untersuchung der Kinetik der systemischen und lokalen Immunantwort in den ersten vier Wochen nach Implantation von Mg, PEEK und PS im Rattenmodell dar.
The objective of the study was the flow cytometric analysis of the foreign body response (FBR) after implantation of pure magnesium (Mg) compared to the permanent biomaterials polyetheretherketone (PEEK) and polystyrene (PS). For the first time, the FBR to pure magnesium implants ought to be described in detail over time, considering the impact of the in vivo corrosion on the local immune response. For this purpose, the processing and the flow cytometric analysis of the foreign body capsule in the rat animal model were established. In addition, systemic effects were examined in blood and spleen after implantation of the biomaterials using flow cytometry. Under general anesthesia, 108 female Lewis rats were included to implant four cylindrical implants (diameter 8 mm, height 2 mm) of a material (PEEK, PS, Mg) after taking a preoperative blood sample. In each animal two implants were placed subcutaneously and two implants intramuscularly. On day 1, 3, 7, 14, 21 and 28 following implantation, under general anesthesia, a final blood sampling with subsequent euthanasia of the animals took place (n = 6 per material and time). The spleen and the im-plants were removed afterwards with the surrounding foreign body capsule. In addition, tissue samples from the immediate vicinity of the foreign body capsules were taken to exclude bacterial contamination by quantitative real-time polymerase chain reaction (RTQ-PCR). For the flow cytometric analysis, vital single-cell suspensions were obtained from spleen, foreign body capsule as well as from the preoperative and final blood samples and then stained with fluorochrome labeled antibodies. In each case, a specific antibody panel for blood/spleen and foreign body capsule analysis was established and used. The validation of the flow cytometric analysis was performed by cell sorting, cytocentrifugation and histological staining. For the Mg implants, the in vivo corrosion rate was calculated using the weight loss method after removal of the corro-sion products. Statistical analysis of time and material group comparisons in blood, spleen and foreign body capsule included a two-way analysis of variance, pairwise comparisons and a Bonferroni-Holm method. Using the established flow cytometric analysis, the characteristic leukocyte populations of the FBR in the foreign body capsule could be identified and quantified. The typical time course of the FBR was shown for all three biomaterials with an initial peak of neutrophils accompanied by an increasing recruitment of monocytes/macrophages into the implant environment. In the chronic inflammatory response and the foreign body reaction, mononuclear and multinuclear macrophages as well as T cells were dominant in the foreign body capsule. Significant differences between Mg and the permanent polymers were found exclusively after subcutaneous implantation and only for the following cell populations: increased proportion of CD4-negative monocytes/macrophages of total leukocyte count (day 1 and 3), increased proportion of mast cells/NK cells of living leukocytes (day 7 and 14) and reduced proportion of late mononuclear and polynuclear macrophages of total leukocyte count (day 14 and 28). After implantation of PEEK, PS and Mg, the analyzed cell populations in the final blood samples were within the generated reference range of the preoperative blood samples throughout the course of the study. The material group comparisons of the blood samples did not show significant differences. In the spleen, there were no substantial differences over time and between implant materials for the examined leukocyte populations. Within the first four weeks after implantation, Mg corroded in vivo with a low corrosion rate accompanied by a clinically irrelevant gas accumulation at the implant site. Bacterial contamination of capsule samples was excluded by RTQ-PCR. In summary, the three implant materials showed a comparable, mild local immune response throughout the course of the study at both implant sites. The subcutaneously discovered material-specific effects of the Mg implants had only limited relevance. A systemic immune response due to implantation could be ruled out. Consequently, the in vivo corrosion of the Mg implants did not exert a potent influence on the FBR compared to PEEK and PS and did not cause a systemic immune response. Overall, the flow cytometric assessment of local and systemic effects after implantation suggested a good biocompatibility of PEEK, PS, and Mg. The established flow cytometric analysis proved to be a suitable tool to study the kinetics of systemic and local immune responses in the first four weeks after implantation of Mg, PEEK, and PS in the rat model.
