Einfluss der GTPase ARFRP1 auf die intestinale Absorption von Makronährstoffen

Abstract

Die GTPase ARFRP1 (ARF-related protein 1) ist ein ubiquitär exprimiertes Mitglied der ARF (ADP ribosylation factor)-Familie, die als GTP-abhängige, molekulare Schalter in der Regulation des intrazellulären Transports und der Golgi-Funktion beteiligt sind. Aktives ARFRP1 assoziiert mit Membranen des trans-Golgi und kontrolliert die Rekrutierung von ARL1 und seinen Effektoren, den GRIP-domain Proteinen, an dieses Kompartiment. Die Darm-spezifische Deletion von Arfrp1 in der Maus führte zu einer frühen, postnatalen Wachstumsretardierung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der Darm-spezifischen Arfrp1-Nullmutante bezüglich der Wachstumsretardierung und der Absorption von Nährstoffen. Zusätzlich sollte die Rolle von ARFRP1 für die Translokation von E-Cadherin an die Plasmamembran epithelialer Zellen untersucht werden. Arfrpvil-/--Mäuse zeigten erniedrigte Blutglucosespiegel, sowie reduzierte Konzentrationen an Triglyceriden und freien Fettsäuren im Plasma, was auf eine Malabsorption als Ursache der Wachstumsretardierung hinwies. Mehrere Experimente zeigten, dass die Absorption von Glucose und Proteinen durch die Abwesenheit von ARFRP1 nicht beeinflusst war. Im Gegensatz dazu wurde mit Hilfe eines oralen Fett- Toleranztests eine eingeschränkte Lipidaufnahme der Arfrp1vil-/--Tiere nachgewiesen, obwohl sie nach oraler Ölgabe Fettsäuren ins Darmepithels aufnahmen und dort als Lipidtropfen akkumulierten. Demnach scheint ARFRP1 an der Formation oder Sekretion von Chylomikronen beteiligt zu sein. Der Mangel von ARFRP1 in den Enterozyten der Arfrp1vil-/--Mäusen beeinflusste die Rekrutierung von Proteinen an den trans-Golgi und dessen Organisation, da ARL1 ausschließlich im Zytosol der Arfrp1vil-/--Enterozyten vorlag und der trans- Golgi-Marker TGN38 in immunhistochemischen Analysen nicht nachweisbar war. Im Gegensatz dazu war die Organisation des cis-Golgis nicht beeinträchtigt. Interessanterweise zeigten die Rab-Proteine Rab2 und Rab6, als Interaktionspartner der Effektoren von ARL1, den GRIP-domain Proteinen, eine veränderte Expression und Lokalisation in Arfrp1vil-/--Enterozyten. Dies zeigt, dass eine direkte Kaskade ARFRP1-ARL1-GRIP-Rab2/6 für die Synthese und/oder die Sekretion von Chylomikronen benötigt wird. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von ARFRP1 in der Regulation der Translokation von E-Cadherin an die Plasmamembran in den Epithelzellen des Darms bestätigt. In Arfrp1vil-/--Tieren verblieben große Teile von E-Cadherin in intrazellulären Membranen des Darmepithels und lagen partiell mit dem cis-Golgi-Marker GM130 ko-lokalisiert vor. Mit Hilfe von Ko-Immunopräzipitationen wurde eine direkte Interaktion von ARFRP1 mit dem E-Cadherin/β-Catenin Komplex nachgewiesen. Dies zeigt eine essentielle Rolle von ARFRP1 für die korrekte Sortierung von E-Cadherin durch den Golgi-Apparat und somit für die Lokalisation des E-Cadherin/β-Catenin Komplexes an der Zelloberfläche.

The GTPase ARFRP1 (ARF-related protein 1) is a member of the family of ADP- ribosylation factors (ARFs) that operate as GTP-dependent molecular switches in the regulation of intracellular protein traffic and Golgi function. It associates with trans-Golgi membranes and controls the recruitment of ARL1 and its effectors, GRIP-domain proteins such as golgin-245. Conditional deletion of Arfrp1 in the intestinal epithelium of mice (Arfrp1vil-/-) as achieved by crossing Arfrp1flox/flox mice with transgenic mice expressing the Cre- recombinase under the villin promoter, resulted in an early postnatal growth retardation. The aim of the present work was to characterise the intestine- specific Arfrp1 nullmutant in respect to the growth retardation and to study its nutrient absorption. In addition, the specific role of ARFRP1 for the targeting of E-cadherin to the cell surface of epithelial cells should be evaluated. Arfrpvil-/- mice revealed decreased levels of blood glucose as well as triglyceride and free fatty acid concentrations in the plasma, indicating that their growth retardation is the consequence of a malabsorption. Several experiments revealed, that glucose and aminoacid absorption was not affected in Arfrpvil-/- mice. In contrast, lipid uptake elucidated by oral fat tolerance tests was impaired in Arfrp1vil-/- mice. However, Arfrp1vil-/- mice transported fatty acids into the intestinal epithelium and accumulated lipid droplets in epithelial cells after an oil bolus. This indicates that ARFRP1 is required either in chylomicron formation or their release. The lack of ARFRP1 in enterocytes of Arfrp1vil-/- mice impaired the recruitment of proteins to the trans-Golgi and altered trans-Golgi organisation, as ARL1 was exclusively located in the cytosol of Arfrp1vil-/- cells and the trans-Golgi marker TGN38 was not detectable by immunohistochemistry. In contrast, the organisation of the cis-Golgi was unaffected as detected by staining with antibodies for GM130 and p115. Interestingly, the Rab proteins Rab2 and Rab6 as interaction partners of the ARL1 effector GRIP-domain proteins, exhibited an altered expression and distribution in Arfrp1vil-/- enterocytes suggesting that a ARFRP1-ARL1-GRIP-Rab2/6 cascade is required for intestinal chylomicron production and/or release. In the second part of the present work the role of ARFRP1 in the regulation of targeting of E-cadherin to the plasma membrane was confirmed for the intestinal epithelium. Arfrp1vil-/- mice exhibited a retention of E-cadherin in intracellular membranes partially colocalising with the cis-Golgi marker GM130 in epithelial cells of the small intestine. In addition, a direct interaction of ARFRP1 with the E-cadherin/catenin complex was demonstrated by co-immunoprecipitation experiments. These data indicate that ARFRP1 is essential for the correct trafficking of E-cadherin through the Golgi and thereby required for the correct cell surface targeting of the E-cadherin complex.