Molekulare Pathomechanismen osteoblastärer Differenzierung bei Urämie: Tumor-Nekrose-Faktor-alpha induziert über extrazellulär aktivierte Kinasen und Aktivatorprotein 1/cFOS eine Induktion von Interleukin-6-Expression

Abstract

Hintergrund Dialysepflichtige Patienten mit fortgeschrittenem, chronischem Nierenversagen haben eine hohe Morbidität und Mortalität aufgrund häufiger kardio-vaskulärer Ereignisse. Traditionell mit diesem Krankheitsbild assoziierte Risikofaktoren wie Dyslipidämie und arterielle Hypertonie erklären dies nur unzureichend. Dialysepatienten zeigen einen beschleunigten arteriosklerotischen Gefäßumbau und arterielle Gefäßmineralisierung, welche die Funktionalität der Gefäße stark beeinträchtigen. Der pathologische Prozess der osteo-chrondroblastären Transition und nachfolgenden Mineralisierung von humanen glatten Gefäßmuskelzellen (VSMCs) in der arteriellen Tunica Media wird möglicherweise durch Urämietoxine ausgelöst, die sich bei Dialysepatienten vermehrt im Blut ansammeln. In der vorliegenden Arbeit wurden zugrundeliegende, molekulare Mechanismen dieser Mineralisierung aufgeklärt, um neue Behandlungsstrategien zu entwickeln.

Methodik Urämische Seren von 14 Dialysepatienten, die im Rahmen der „Permeability Enhancement to Reduce Chronic Inflammation“ (PERCI-I)-Studie rekrutiert worden waren, wurden auf die proinflammatorischen Biomarker Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) als Mediatoren urämieinduzierter Inflammation mittels ELISA getestet und mit Seren gesunder Kontrollen verglichen. Mechanistische Untersuchungen zur transkriptionellen Regulation von IL-6 erfolgten mittels Promotor-Deletions-Analysen und Elektro-Mobility-Shift-Assays in VSMCs, die mit gepoolten urämischen bzw. Kontrollseren oder TNF-α stimuliert wurden. Die Spezifität des dabei identifizierten Transkriptionsfaktors wurde durch pharmakologische Inhibierungsexperimente überprüft und Westernblots zur Untersuchung der upstream Singnaltransduktion abgeschlossen. Spezifische - an der osteochondroblastären Transition beteiligte - Gene wurden mittels real-time PCR analysiert. Alkalische Phosphatase-messungen und Kalzifizierungsassays dienten zur funktionellen Untersuchung der VSMC-Mineralisierung.

Ergebnisse Im Vergleich zu gesunden Kontrollen zeigten Seren urämischer Patienten signifikant erhöhte Spiegel von TNF-α und IL-6. In VSMCs induzierte urämisches Serum eine TNF-α-abhängige IL-6-Induktion sowie eine osteochondoblastäre Transition und signifikante Mineralisierung. Dies wurde über die extrazelluläre-signal-regulierte Kinase-1 (ERK-1) und den Aktivierungs-Protein-1 (AP-1) / c-FOS-Transkriptionsfaktorkomplex vermittelt, welcher im IL-6-Promotor bindet. Die pharmakologische Inhibition von TNF-α, IL-6, ERK-1 und AP-1/cFOS reduzierte die osteochondroblastäre Transition und Mineralisierung und verbesserte das Zellüberleben.

Schlussfolgerung Die urämiebedingte, chronische Inflammation bei Dialysepatienten geht mit einer systemischen Erhöhung von TNFα und IL-6 einher. Insbesondere die TNF-α-induzierte IL-6-Produktion in VSMCs wurde als neuer entscheidender Faktor der vaskulären Mineralisierung in VSMCs identifiziert. Eine auf den spezifischen Patienten abgestimmte, pharmakologische Blockade von TNF-α und IL-6 könnte somit neben dem Einsatz neuartiger Dialysemembranen mit verbesserter Elimination urämischer Toxine eine interessante, neuartige Therapieoption zur Reduktion der Gefäßmineralisierung bei Hämodialysepatienten darstellen.

Introduction Patients under dialysis-treatment for end-stage renal disease (ESRD) display a highly increased cardio-vascular morbidity and mortality but risk-factors traditionally associated with ESRD such as dyslipidemia and arterial hypertension fail to fully explain this phenomenon. Vascular function is impaired in those patients since arteriosclerotic processes such as osteoblastic transition (OT) and subsequent vascular mineralization (VM) are accelerated in chronic dialysis. OT and VM are predominantly located in vascular smooth muscle cells (VSMCs) of the arterial tunica media and are triggered by uremic toxins, which are elevated in ESRD-patients. Aim of this study was to assess molecular pathomechanisms of OT and VM in VSMCs to identify potential treatment-options.

Methods Uremic sera from 14 patients with ESRD recruited within the “Permeability Enhancement to Reduce Chronic Inflammation” (PERCI-I)-trial at the dialysis centre of Charité-Universitätsmedizin Berlin, were compared to sera from healthy controls regarding proinflammatory biomarkers tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin 6 (IL-6) by ELISA. Genetic studies of the IL-6 promotor with promotor-deletion-assays and Electro-Mobility-Shift-Assays together with experiments with pharmacological inhibitors to characterize signaling pathways in VSMCs with pooled uremic and control sera of TNF-α were conducted. In addition, gene expression studies with markers for OT and determination of alkaline phosphatase as well as calcification assays were performed to study VSMC-mineralization.

Results When compared with healthy controls, predialytic sera showed significantly increased levels of TNF-α and IL-6. Importantly, VSMCs demonstrated a TNF-α-mediated IL-6-induction in response to uremic sera, which was dependent on the Extracellular-signal-Regulated-Kinase-1 (ERK-1) and the Activator-Protein-1 (AP-1)/c-FOS complex transcription factor binding to the IL-6-promotor. In vitro, TNF-α and IL-6 strongly induced calcification of VSMCs and pharmacological inhibition of TNF-α, IL-6, ERK-1 and AP-1/cFOS reduced OT, mineralization and improved cell-survival.

Conclusion Uremia in ESRD is characterized by a state of chronic inflammation with systemically elevated levels of TNF-α and IL-6. This is the first study to elucidate underlying pathomechanisms of OT and VM in humans identifying TNF-α-induced IL-6-production as an important new factor. This process could be further characterized by signaling via ERK-1 and AP-1/cFOS. Personalized pharmacological inhibition of TNF-α and IL-6 in patients with ESRD appears to be promising to reduce OT and VM and improve cardio-vascular-outcomes in those patients. Therefore, clinical studies should be encouraged to assess TNF-α-, and IL-6-inhibition as well as the use of dialysis membranes with improved clearance of uremic toxins.