Ziel der Arbeit war die Charakterisierung des neu generierten MMex38-Mausmodells. Dieses stellt das erste Tiermodell für die Gliedergürtelmuskeldystrophie Dysferlinopathie dar, bei der die Erkrankung durch eine Missense-Mutation und Proteinfehlfaltung hervorgerufen wird. Die Dysferlinopathie ist eine seltene autosomal rezessiv vererbte Muskelkrankheit. Ein Drittel aller krankheitsverursachenden Mutationen sind Missense-Mutationen. Durch Punktmutation im Dysferlingen (DYSF) und konsekutiver Proteinfehlfaltung kommt es zur intrazellulären Proteinaggregation, vorzeitigem Proteinabbau und Funktionsverlust des Proteins. Derzeit existiert kein kausaler Therapieansatz. Durch die Behandlung dysferlindefizienter primärer, humaner Myotuben mit kurzen Dysferlinpeptiden, konnte das endogene, fehlgefaltete Dysferlin an die Muskelzellmembran relokalisiert werden und seine Funktion als Membranreparaturprotein wiederaufnehmen. Es wurde ein knock-in- Mausmodell mit einer Punktmutation in Exon 38 generiert (Dysf p.L1360P; analog zur humanen Mutation DYSF p.L134P) um den oben genannten Therapieansatz in vivo zu testen. Muskelhistologie- und Physiologie wurden in zwölf, zwanzig und sechzig Wochen alten Mäusen untersucht. Unsere aktuellen Daten weisen auf eine Beeinträchtigung der Glykolyse im dysferlindefizienten Muskel hin. Daher wurde der Einfluss einer ketogenen Diät auf den Krankheitsverlauf in MMex38- und Wildtyp-Versuchstieren getestet. Die Proteinexpression war in MMex38-Muskeln essentiell reduziert und am Sarkolemm konnte kein Dysferlin nachgewiesen werden. Das Gesamtkörpergewicht war in zwanzig Wochen alten MMex38-Mäusen erhöht, wohingegen die fettfreie Masse reduziert war. Die Muskelmasse einzelner Muskeln war erniedrigt. Histologisch konnten Muskeldystrophie in Form von nekrotischen Fasern, regenerierenden Fasern, zentralisierten Zellkernen und entzündlichen Veränderungen sowie Amyloidablagerungen nachgewiesen werden. Histopathologische Veränderungen waren bereits mit zwölf Wochen nachweisbar und mit dem Alter zunehmend. Dreiwöchige Laufbandbelastung führte zu einer signifikanten Beeinträchtigung der 4 Ausdauerleistung ab einem Alter von zwanzig Wochen. Die Beurteilung der Muskelmembranreparatur zeigte eine verzögerte Membranversiegelung nach Schädigung. Eine ketogene Ernährung konnte in zwanzig Wochen alten MMex38-Mäusen eine Verbesserung der Ausdauerleistung induzieren. Histologisch zeigten sich eine Zunahme der nekrotischen Fasern sowie leichte Faseratrophie im M. quadriceps und eine Abnahme der Fasern mit zentralisierten Zellkern im M. tibialis anterior. Es wurde belegt, dass die Generierung eines dysferlindefizienten Mausmodells mit Proteinfehlfaltung für die Dysferlinopathie erfolgreich war. Die Mutation führte analog zu den humanen krankheitsspezifischen Veränderungen im Tiermodell zu den erwarteten pathologischen Charakteristika der Proteinfehlfaltung. Die Progredienz der Erkrankung konnte durch signifikant steigende Parameter dargestellt werden. Dieses Mausmodell eignet sich daher für weitere therapeutische in vivo Studien unter Beachtung verschiedener pathophysiologischer Parameter. Die Ernährungsintervention führte zu messbaren Veränderungen in der Krankheitsprogression. Der Einfluss einer ketogenen Diät auf die Dysferlinopathie konnte dabei nicht eindeutig geklärt werden. Sollten klinische Studien diesbezüglich erwogen werden, ist zunächst eine kurzfristige, medizinisch betreute Ernährungsumstellung voranzustellen, um unerwünschte Effekte frühzeitig zu detektieren.
The aim of this thesis was the characterization of the newly generated MMex38- mouse model. It is the first animal model for the limb girdle muscular dystrophy dysferlinopathy, which is caused by a missense mutation and protein misfolding. Dysferlinopathy is a rare autosomal recessive muscle disease. One third of all disease- causing mutations are missense mutations. Point mutation in the dysferlin gene (DYSF) and consecutive protein misfolding results in intracellular protein aggregation, premature protein degradation and loss of functional protein. There is no therapy. It could be shown that by treating primary human myotubes with short dysferlin peptides, endogenous misfolded dysferlin relocated to the sarcolemma where it regained its proper function as a membrane repair protein. 5 A knock-in mouse with a missense mutation in exon 38 (Dysf p.L1360P, analogous to the human mutation DYSF p.L1341P) was generated to test this approach in vivo. Muscle physiology and histology were characterized at twelve, twenty and sixty weeks of age. Due to the assumption of impaired glycolysis in dysferlin-deficient muscles, the effects of a ketogenic diet on the disease progression was tested in MMex38-mice and wild type controls. Protein expression was substantially reduced in MMex38 skeletal muscle and sarcolemmal dysferlin was absent. Total body weight of 20-week-old MMex38 was increased with reduced percentage of lean tissue. Single muscle mass was decreased. Histology revealed muscular dystrophy with necrotic fibers, regenerating fibers and inflammation. Amyloid formation could be found in MMex38-muscle. The changes were prominent in twelve-week-old MMex38 and worsened with age. Three weeks of treadmill exercise exposed significant endurance impairment in 20-week-old MMex38. The membrane-wounding assay demonstrated delayed membrane resealing. A ketogenic diet induced an improvement of running distance in 20-week-old-MMex38. Muscle histology showed fiber atrophy and increase of necrotic fibers in the quadriceps muscle and reduced fibers with centrealized nuclei in the tibialis anterior muscle. The targeted mutation induced all characteristics of protein misfolding in dysferlinopathy in analogy to the human disease course. The continuous disease progression in adulthood could be monitored by statistically significant changing parameters. The successful generation of an animal model for protein misfolding in this muscular dystrophy can be taken into consideration and allow for further preclinical therapeutic trials. The ketogenic diet led to measurable changing parameters, however the effects of the diet could not be definitely revealed. Therefore testing the diet in patients for a shorter time period and under medical guidance should be performed prior to clinical studies.
