Temporal and Spatial Regulation of Rho GTPase Activity and Specificity

Abstract

Rho GTPases are central signalling nodes in pathways that regulate cytoskeletal dynamics and control complex cellular functions such as cell adhesion, cell migration, and cell division. Rho GTPases are molecular switches: They exist in an active GTP-bound state and an inactive GDP-bound state. The transition between these states relies on the activating Rho guanine nucleotide exchange factors (RhoGEFs) and the inactivating Rho GTPase activating proteins (RhoGAPs). The number of signalling pathways up- and downstream of Rho GTPases is multitudinous and so is the large number of GAPs and GEFs, reflecting the diversity of physiological processes that involve Rho GTPase signalling. The human genome encodes as many as 150 of these regulatory proteins. Rho guanine nucleotide dissociation inhibitors (RhoGDIs) add an additional layer of regulation to the localization and activity of Rho GTPases. They bind to and stabilise Rho GTPases and thus create a soluble cytosolic pool of inactive Rho proteins. Understanding the substrate specificity of the RhoGEFs and RhoGAPs is important in order to link them to their downstream signalling pathways. However, this has never been investigated in a systematic manner and is yet unknown for many GAPs and GEFs. I employed a previously assembled complete expression library of all full length RhoGEFs and RhoGAPs to systematically describe their activity towards any of the three paradigm Rho GTPases RhoA, Rac1 and Cdc42. For this purpose, I established a novel automated microscopic live cell RhoGEF and RhoGAP assay, based on second generation FRET biosensors for RhoA, Rac1, and Cdc42. The sensitivity of the assay was significantly enhanced by the modulation of cellular RhoGDI levels. I could show that the assay is very robust and suited to visualize subtle activity changes within living cells. I found that RhoGEFs have mostly exclusive activity, whereas RhoGAPs can have both exclusive and promiscuous activity. Furthermore, by applying semiquantitative image analysis I could demonstrate that autoinhibition is a common mechanism by which RhoGEFs and RhoGAPs are regulated in cells. I furthermore performed a family-wide analysis of RhoGEF and RhoGAP localization at focal adhesions and identified as many as 37 of them residing at these structures. Subsequent correlation of their substrate specificity suggests a key role of Rac1 in the regulation focal adhesion dynamics. Along with activity, also the membrane association of Rho GTPases is tightly regulated. However, RhoGDI-mediated shuttling between membranes and rapid diffusion of Rho GTPases within membranes intuitively counteract spatially confined Rho signals and how Rho activity is locally initiated, maintained and terminated is not known. I analysed features that control the subcellular localisation of Rho GTPases and established the dynamic nature of Rho GTPase membrane residence. I could demonstrate that this dynamic membrane interaction is not primarily caused by RhoGDI but rather due to rapid lateral diffusion. In order to more precisely decipher the spatio-temporal signalling framework of Rho GTPases at the plasma membrane, I advanced the establishment of a single molecule tracking approach for Rho proteins. This assay can be used in future work to systematically investigate factors that regulate the spatial concentration of Rho GTPase activity. Altogether, my study provides a systemic framework to place the Rho GTPases RhoA, Rac1, and Cdc42 into the complex network of up- and downstream signalling pathways and thus a basis for a better understanding of the spatio-temporal regulation of Rho GTPase signalling.

Rho GTPasen sind zentrale Signalproteine in einem komplexen und weitreichenden Netzwerk intrazellulärer Signalwege, welche durch Organisation und Umbau des Zytoskeletts unter anderem Zellmigration, Zelladhäsion und Zellteilung kontrollieren. Als molekulare Schalter können Rho-Proteine einen aktiven GTP-gebundenen und einen inaktiven GDP-gebundenen Zustand einnehmen. Die Aktivierung der Rho GTPasen erfolgt durch GTP-Austauschfaktoren (GEFs), die Inaktivierung durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs). Entsprechend der Vielzahl der Signalwege, die durch Rho GTPasen kontrolliert werden, sind auch die regulatorischen RhoGEFs und RhoGAPs zahlreich, was die Komplexität der physiologischen Prozesse wider spiegelt, die durch Rho-Proteine reguliert werden. Das humane Genom enthält 150 dieser Rho-Regulatorproteine. Zusätzlich werden Rho GTPasen durch Guaninnukleotid-Dissoziations-Inhibitoren (RhoGDIs) reguliert. Diese binden an die posttranslationale Lipidmodifikation der Rho GTPasen und versetzen diese dadurch in einen löslichen Zustand, wodurch ein inaktiver zytosolischer Fundus an Rho GTPasen geschaffen wird. Das Verständnis um die Substratspezifität von RhoGEFs und RhoGAPs ist unerlässlich, um diese in nachfolgende Signalwege einordnen zu können. Die Substratspezifität wurde jedoch noch nie umfassend und systematisch untersucht und ist für viele der RhoGEFs und RhoGAPs gänzlich unbekannt. Ich habe auf der Grundlage einer zuvor generierten Expressionsbibliothek systematisch die Aktivität aller RhoGEFs und RhoGAPs gegenüber jeder der drei wichtigen Rho GTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42 untersucht. Zu diesem Zweck habe ich mithilfe der neuesten FRET Biosensoren für RhoA, Rac1 und Cdc42 eine neue, automatisierbare und auf Mikroskopie basierende Methode entwickelt. Die Sensitivität dieses Assays wurde zusätzlich, durch die gezielte Veränderung der RhoGDI Expressionslevel, signifikant gesteigert. Ich konnte darüber hinaus zeigen, dass der Assay zuverlässig selbst kleinste Aktivitätsveränderungen in lebenden Zellen wiedergeben kann. Dadurch konnte ich feststellen, dass RhoGEFs größtenteils Aktivität gegenüber einzelnen Rho GTPasen haben, wohingegen RhoGAPs sowohl Aktivität gegenüber einzelnen, als auch mehreren Rho GTPasen haben. Eine semiquantitative Analyse der Aktivitäten einiger RhoGEFs und RhoGAPs zeigte, dass die meisten dieser Regulatoren in Zellen autoinhibitorischen Regulationsmechanismen unterliegen. Außerdem habe ich die gesamte Familie der RhoGEFs und RhoGAPs auf ihre Lokalisation an Fokalen Adhäsionen untersucht, wodurch ich 37 dieser Proteine identifiziert habe, die dort lokalisieren. Eine anschließende Korrelation mit der Substratspezifität hat ergeben, dass Rac1 vermutlich eine Schlüsselfunktion für die Regulation der Fokalen Adhäsionen hat. Neben der Aktivität ist auch die Membranassoziation von Rho GTPasen genauestens reguliert. Der Transport von Rho GTPasen durch RhoGDI zwischen zellulären Membranen und ihre schnelle laterale Diffusion an Membranen widerspricht jedoch intuitiv einer räumlich begrenzten Anreicherung von Rho Aktivitäten. Wie daher die Signaltransduktion von Rho GTPasen lokal initiiert, aufrechterhalten und wieder beendet wird, ist nicht bekannt. Ich habe hier Strukturelemente untersucht, die die subzelluläre Lokalisation von Rho GTPasen steuern und festgestellt, dass Rho GTPasen sehr dynamisch an Membranen binden. Ich konnte darüber hinaus zeigen, dass diese dynamische Membraninteraktion nicht primär RhoGDI geschuldet ist, sondern eher durch schnelle laterale Diffusion zustande kommt. Um die zeitliche und räumliche Kontrolle der Prozesse, die der Rho Signaltransduktion an Membranen zugrunde liegen, präzise auftrennen zu können, habe ich die Entwicklung einer Einzelmolekülmikroskopie Methode für Rho-Proteine vorangetrieben. Mit dieser Methode wird das Ziel verfolgt werden systematisch nach Faktoren zu suchen, durch welche die räumliche Anreicherung von aktiven Rho GTPasen gewährleistet werden kann. Mit dieser Studie habe ich systembiologisch relevante Informationen erarbeitet, durch die sich die Rho GTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42 in dem weitgefächerten und hochkomplexen Netzwerk ihrer Signalwege platzieren lassen und habe dadurch eine wichtige Grundlage zum Verständnis der zeitlichen und räumlichen Regulation der Rho Signaltransduktion gelegt.