Background: In prostate cancer patients, high circulating levels of interleukin-6 (IL-6) correlate with disease progression and bone metastatic lesions. Studies have shown that IL-6 stimulates the “classical” vicious cycle of bone metastasis by inducing the expression of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) on osteoblasts. As PC3 cells secrete large amounts of IL-6, we hypothesize that autocrine IL-6 signaling promotes tumor growth in bone by increasing the synthesis of receptor activator of nuclear factor kappa B (RANK) in cancer cells, sensitizing these cells for direct crosstalk with RANKL-bearing osteoblasts.
Materials and Methods: The in vitro effects of human IL-6 on RANK and parathyroid hormone-related protein (PTHrP) mRNA expression in PC3 cells were assessed by using real-time quantitative reverse transcription PCR. To determine how autocrine IL-6 signaling contributes to prostate cancer growth in bone, we inoculated human PC3 xenografts intra-tibially into nude mice and blocked autocrine IL-6 receptor signaling using tocilizumab and bone resorption using zoledronic acid for a period of 30 days. Tumors were analyzed by histomorphometry, immunohistochemistry for Ki-67 and RANK expression as well as by TUNEL staining. Osteolytic lesions were measured by X-ray images, the numbers of osteoclasts at the tumor-bone interface, serum RANKL and tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRAcP 5b) levels. In a second experiment, we injected PC3 xenografts subcutaneously into nude mice and analyzed the tumors by calculating their volumes every 3 days, by immunohistochemical staining for RANK expression and by determining their mass following euthanasia of mice at day 58.
Results: Treatment of PC3 cells with human IL-6 upregulated RANK and PTHrP mRNA expression in vitro and tocilizumab reduced this effect. The intra-tibial xenograft murine model revealed that tocilizumab significantly inhibited PC3 tumor growth, associated with higher apoptosis and lower cell proliferation rates compared to untreated controls. Parameters of bone resorption were also significantly decreased in tocilizumab-treated mice, showing reduced osteolytic lesions in X-rays, osteoclast numbers at the tumor-bone interface, serum RANKL and TRAcP 5b levels. In contrast, therapy with tocilizumab did not show any effects in the subcutaneous xenograft mouse model in terms of tumor volume, tumor mass and RANK receptor expression.
Conclusions: In the current study, we demonstrate that PC3 tumor cells communicate directly with osteoblast lineage cells by signaling through feed forward loops involving IL-6, RANKL and RANK. This molecular triad promotes metastatic cancer growth in bone by (i) operating as an additional and amplifying element within the framework of the classical vicious cycle and by (ii) mediating cancer cell motility as well as directional migration towards a RANKL source
Hintergrund: Erhöhte Werte von Interleukin-6 (IL-6) im Plasma korrelieren in Prostata-Krebspatienten mit Krankheitsprogression und dem Auftreten von Knochenmetastasen. Studien konnten zeigen, dass IL-6 die Bildung von 'receptor activator of nuclear factor kappa B ligand' (RANKL) auf Osteoblasten induziert und dadurch den „klassischen“ Teufelskreis der Knochenmetastasierung aktiviert. Da PC3-Tumorzellen große Mengen von diesem Zytokin sezernieren, stellen wir die Hypothese auf, dass autokrin wirksames IL-6 das Tumorwachstum im Knochen befördert, indem es die Synthese von 'receptor activator of nuclear factor kappa B' (RANK) in Krebszellen begünstigt und dadurch Tumorzellen für eine direkte Kommunikation mit RANKL exprimierenden Osteoblasten sensibilisiert. Materialien und Methoden: Die Wirkungen von IL-6 auf die RANK und 'parathyroid hormone-related protein' (PTHrP) mRNA Synthese von PC3-Zellen wurden mithilfe einer 'real-time quantitative reverse transcription PCR' ermittelt. Um zu beurteilen wie autokrin wirksames IL-6 zum Tumorwachstum im Knochen beiträgt, injizierten wir PC3-Krebszellen in Tibiae von Nacktmäusen und hemmten für eine Dauer von 30 Tagen das autokrine IL-6-Signal per Tocilizumab sowie die Knochenresorption durch Zoledronsäure. Die Neoplasien wurden mittels Histomorphometrie, immunohistochemischer Darstellung von Ki-67 und RANK sowie anhand des Ausmaßes der Apoptose mit TUNEL-Färbung analysiert. Osteolytische Läsionen wurden mittels Röntgenbilder, Plasmakonzentrationen von RANKL, 'tartrate-resistant acid phosphatase 5b' (TRAcP 5b) und der Anzahl von Osteoklasten an der Tumor-Knochen-Schnittstelle gemessen. Um die Rolle von IL-6 weiter zu definieren, injizierten wir PC3-Tumorzellen in einem zweiten Experiment subkutan in Nacktmäusen und berechneten die Volumina der daraus entstehenden Tumoren alle 3 Tage, stellten den Grad der Tumor-RANK-Synthese anhand von Immunohistochemie dar und analysierten die Tumormasse nach Versterben der Mäuse am 58. Tag. xv Ergebnisse: Humanes IL-6 bewirkte in vitro eine erhöhte RANK- und PTHrP-mRNA-Synthese, die Tocilizumab durch Blockierung der IL-6 Rezeptoren reduzierte. In vivo verminderte Tocilizumab das Tumorwachstum im Knochen statistisch signifikant, das im Vergleich zur Placebogruppe mit einer erhöhten Apoptose- und einer erniedrigten Proliferationsrate assoziiert war. Tocilizumab behandelte Mäuse wiesen ebenfalls signifikant erniedrigte Knochenresorptionsparameter auf, was sich in kleineren osteolytischen Läsionen in Röntgenbildern, einer verminderten Anzahl von Osteoklasten an der Tumor-Knochen-Schnittstelle sowie in reduzierten Serumkonzentrationen von RANKL und TRAcP 5b widerspiegelte. Im Gegensatz dazu zeigte die Therapie mit Tocilizumab keine Effekte im subkutanen Mausmodell bezüglich der Größe des Tumorvolumens, der Tumormasse sowie der RANK-Rezeptor-Synthese. Schlussfolgerungen: Die gegenwärtige Studie zeigt, dass PC3-Tumorzellen über positive Rückkopplungsmechanismen, bestehend aus den Zytokinen IL-6, RANKL und RANK, direkt mit Osteoblasten kommunizieren. Dieses Triumverat begünstigt metastatisches Tumorwachstum, indem es (i) als komplementäres und verstärkendes Element innerhalb des klassischen Teufelskreises agiert, und (ii) die Motilität sowie die direkte Migration von Krebszellen in Richtung eines RANKL-Gradienten vermittelt.
