Der Einfluss endogener und exogener Faktoren auf Podozyten und Nierenfunktion

Abstract

Einleitung: Humane Podozyten (hPC) stellen hochdifferenzierte Zellen dar, die einen elementaren Bestandteil der renalen Filtrationsbarriere bilden. Ihre intensive Erforschung in vitro ist erst seit wenigen Jahren möglich. Schädigungen der hPC durch Diabetes mellitus oder Bluthochdruck (Nephrosklerose) gehen häufig mit einem renalen Funktionsverlust einher. Das orale Biguanid-Antidiabetikum Metformin kann erhöhte Blutglukosespiegel und die Entwicklung einer Albuminurie vermindern. Angiotensin (Ang) II reguliert den Blutdruck und die intrarenale Hämodynamik. Diese Arbeit untersucht die Modifikation der intrazellulären Expression und Phosphorylierung von AMPK, Akt1 und des mechanistic Target of Rapamycin (mTOR) sowie das Zellüberleben von hPC durch Stimulation mit Glukose und Metformin. Darüber hinaus wird die Regulation des Glykoproteins Podoplanin (PDPN) in hPC durch AngII und miR-29b untersucht. Weiterhin wurde in einer in vivo Studie die Bedeutung von Testosteron auf die Entwicklung einer progressiven Albuminurie männlicher Tiere im Tiermodell der Munich Wistar Frömter (MWF) Ratte untersucht. Methodik: Ausdifferenzierte hPC wurden verschiedenen Konzentrationen von Glukose und Metformin oder AngII ausgesetzt. Die Transfektion mit small interfering RNA oder miRNA-Mimics erfolgte mittels Lipofectamine®2000. Proteinexpression und Phopshorylierungsgrad wurden durch Western Blots bestimmt. Zellapoptose und Zellviabilität wurden über funktionelle Assays erfasst. Männliche MWF-Ratten wurden in der zehnten Woche orchiektomiert. Die einzelnen Gruppen wurden scheinoperiert, mit Testosteron oder Testosteron plus Flutamid behandelt. Als Kontrolle dienten Wistar-Ratten. Bestimmt wurden der Testosterongehalt im Blut und die Albuminausscheidung im Urin (UAlb). Ergebnisse: Metformin hemmt die Phosphorylierung von AMPK und induziert die mTOR-Phosphorylierung. Unter Hochglukosebedingungen (HG)-Bedingungen regt Metformin die zelluläre Produktion von AMPK und Akt1 an, reduziert jedoch die zelluläre mTOR-Expression. Damit erhöht es das Zellüberleben unter HG signifikant. AngII induziert eine erhöhte miR-29b-Expression und reduziert die PDPN-mRNA und -Proteinexpression. Proapoptotische Effekte wie die Cytosol-C-Verteilung und die Caspase3-Aktivierung waren verstärkt. Die erhöhte UAlb bei MWF konnte durch durch Orchiektomie signifikant reduziert werden. Eine gleichzeitige Behandlung mit Testosteron plus Flutamid bewirkte bei MWF-Tieren eine weitere, signifikante Absenkung der UAlb. Schlussfolgerung: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Metformin direkt auf hPC wirken und unabhängig von einer systemischen Absenkung des Blutzuckerspiegels proapoptotischen Effekte unter HG abschwächen sowie das Zellüberleben verbessern kann. Die zelluläre Integrität von hPC wird durch AngII beeinflusst. Über miRNA-29b wird die PDPN-Expression reguliert. PDPN ist für den Funktionserhalt, Stresstoleranz und Überleben der hPC relevant. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass Testosteron in die pathologische Albuminurieentwicklung bei männlichen Ratten involviert ist. Um aus diesen Studien mögliche renoprotektive Maßnahmen für die Klinik abzuleiten, sind weiterführende Arbeiten nötig.

Introduction: Human podocytes (hPC) are highly differentiated cells and representing an important part of the renal filtration barrier. Methods to study hPC in in vitro were only recently established. Damage to hPCs due to diabetesmellitus or hypertension frequently leads to renal impairment. The oral biguanid Metformin can reduce blood glucose levels and prevent the development of albuminuria. Angiotensin (Ang) II regulates blood pressure and intrarenal hemodynamic. This work examines the modification of expression and phosphorylation of AMPK, Akt1 and mTOR as well as the cell survival of hPC after stimulation with glucose and Metformin. Furthermore, the regulation of glycoprotein podoplanin (PDPN) in hPC through Ang II and miR-29b is examined. Additionally, an in vivo study investigated the effect of testosterone on the development of progressive albuminuria in male Munich Wistar Frömter (MWF) rats. Methods: Differentiated hPC were exposed to various concentrations of glucose and Metformin or AngII. The transfection with small interfering RNA or miRNA-mimics was done with Lipofectamine®2000. Protein expression and phosphorylation were determined with Western blots. Cell apoptosis and viability were measured with functional assays. Male MWF rats were orchiectomized at ten weeks of age. MWF were sham operated or treated with either testosterone or testosterone plus flutamid. Wistar rats were used as controls. Testosterone serum levels and urinary albumin excretion (UAlb) were measured. Results: Metformin inhibits AMPK phosphorylation and induces mToR phosphorylation. Under high glucoses conditions (HG) metformin stimulates cellular production of AMPK and Akt1 but reduces cellular mTOR expression. This significantly increases cell survival under HG. AngII induces miR-29b expression and reduces cellular mRNA and protein expression of PDPN. Proapoptotic effects such as Cytosol-C distribution and Caspase3 activation were elevated. Testosterone serum concentrations and increased albuminuria in male MWF was significantly reduced by orchiectomy. Concomitant treatment with testosterone plus lead to a further significant decrease of UAlb in MWF. Conclusion: Metformin affects hPC directly. Metformin reduces apoptosis under HG and increases cell survival independently from systemic blood sugar reduction. Cellular integrity of hPC is influenced by AngII. PDPN expression is regulated through miRNA-29b. PDPN is of relevance for function, stress tolerance and survival of hPC. Furthermore, testosterone is involved in the development of increased albuminuria in male rats. To generate future renoprotective applications from these studies for clinical use, further investigation is required.