Interaktionen zwischen Bestrophin-1 und der GTPase Rab27a: Effekte krankheitsbedingender Mutationen

Abstract

Mutationen im BEST1 rufen eine Reihe retinaler Erkrankungen hervor, darunter die Best’sche vitelliforme Makuladystrophie (BVMD). Das Genprodukt von BEST1 ist Bestrophin-1, welches größtenteils in der basolateralen Membran des retinalen Pigmentepithels (RPE) zu finden ist. Es handelt sich hierbei um einen pentamerischen Anionenkanal, der zudem als Regulator der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration sowie anderer Ionenkanäle fungiert. Da die physiologische Funktion nicht abschließend geklärt ist, sind auch die Pathomechanismen der BVMD bislang unklar. Ein krankheitsverursachendes Phänomen besteht im Versagen des intrazellulären Traffickings mutanter Bestrophine, welche ihre basolaterale Lokalisation verloren haben. Es bestehen Hinweise auf eine mögliche Interaktion von Bestrophin-1 mit der kleinen GTPase Rab27a, die an intrazellulären Transportprozessen beteiligt ist. In der vorliegenden Studie sollte untersucht werden, ob eine solche Wechselwirkung existiert und welche Mechanismen ihr gegebenenfalls zugrunde liegen. Zu diesem Zweck wurden mithilfe transfizierter CHO-Zellen Koimmunpräzipitationen zwischen Rab27a und wildtypischem Bestrophin-1 sowie verschiedenen mutanten Formen durchgeführt, darunter vier bekannte BVMD-assoziierte Mutanten (T6P, F80L, R218C, F305S). Weitere Mutanten, zum Teil eigens dafür hergestellt, denen strategisch einzelne Bereiche der Aminosäuresequenz fehlten, wurden gezielt für die Suche nach einer Bindungsdomäne eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Koimmunpräzipitation in allen Experimenten stattfand, diese war jedoch bei zwei der natürlich vorkommenden Mutanten (T6P, F305S) deutlich eingeschränkt. Zusätzlich wurden die Proteine in vivo in transfizierten CHO-Zellen immunzytochemisch untersucht. Bei allen mutanten Bestrophinen war die intrazelluläre Verteilung und Kolokalisation mit Rab27a im Vergleich zum Bestrophin-1-Wildtyp beeinträchtigt. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Bestrophin-1 und Rab27a tatsächlich interagieren. Es gelang bisher nicht, eine Interaktionsdomäne zu bestimmen. Jedoch konnten zwei vielversprechende Bereiche identifiziert werden, die in Zukunft näher untersucht werden sollten. Da diese auch die Ca²⁺-Bindung des Bestrophin-1 vermitteln, erscheint ein Einfluss von Ca²⁺ auf die Interaktion wahrscheinlich. Eine Beteiligung weiterer vermittelnder Interaktionspartner ist möglich. In der Pathogenese der BVMD könnte Rab27a bei einigen Mutationen eine Rolle spielen, etwa indem durch eine eingeschränkte Interaktion der subzelluläre Transport oder die Kanaleigenschaften des Bestrophin-1 beeinträchtigt oder Phagozytoseprozesse im RPE beeinflusst werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei verschiedenen ursächlichen Mutationen unterschiedliche pathogenetische Mechanismen zum Tragen kommen. Rab27a ist vermutlich nur bei einigen beteiligt und auch in diesen Fällen nicht alleine für die typische Symptomatik verantwortlich.

Mutations in BEST1 result in several different retinal degenerative diseases, amongst them Best macular dystrophy. The gene product of BEST1 is bestrophin-1, which can mostly be found at the basolateral side of the retinal pigment epithelium (RPE). Bestrophin-1 is a pentameric anion channel which also appears to function as a regulator of the intracellular Ca²⁺-concentration as well as a modulator of other ion channels. Since the physiological function of bestrophin-1 is not yet fully discovered, pathomechanisms of Best disease are still largely unknown. One pathogenic mechanism seems to involve failure of intracellular trafficking of mutant bestrophin-1 resulting in loss of basolateral localization. There are hints of a possible interaction of bestrophin-1 with Rab27a, a small GTPase involved in intracellular transport mechanisms. This study aims to detect whether there is such an interaction and on which mechanisms this interaction is based. Therefore, co-immunoprecipitation between Rab27a and both bestrophin-1 wildtype and several mutant forms transfected into CHO cells was performed, some of the mutants being associated with Best disease (T6P, F80L, R218C, F305S). Other mutants, strategically missing parts of the amino acid sequence – some of which were specially created for this purpose – were used to determine a possible binding domain. It could be demonstrated that there is co immunoprecipitation taking place in all the experiments, though clearly attenuated in two of the naturally occurring mutants (T6P, F305S). Additionally, immunocytochemical stainings were employed to further investigate the proteins in vivo in transfected CHO cells. All mutant forms were shown to be mislocalized and to exhibit reduced co localization with Rab27a compared to bestrophin-1 wildtype. These results show that there clearly is some kind of interaction taking place. So far, no interaction domain could be identified. However, it was possible to determine two highly promising domains which should be further investigated. These domains mediate bestrophin-1 binding to Ca²⁺, making it probable that bestrophin-1/Rab27a interaction is Ca²⁺ dependent. Other interposed interaction partners might mediate the binding. In the pathogenesis of Best disease, Rab27a could possibly play a role, a reduced interaction for instance leading to impaired subcellular transport or altered ion channel properties of bestrophin-1 or playing a part in phagocytic processes in the RPE. The results indicate that for different disease-causing mutations, distinct pathomechanisms come into effect. Only for some of them Rab27a seems to be of importance, although even then it is probably not responsible for all of the typical symptoms of Best disease.