Receptors and signaling pathways for the detection of viable bacteria by human phagocytes

Abstract

Das angeborene Immunsystem bildet die erste Verteidigungslinie gegen mikrobielle Invasion. Per definitionem enthalten alle Mikroben hoch konservierte, molekulare Strukturen, die als Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) bezeichnet werden. PAMPs werden durch angeborene Immunzellen über ein breites Repertoire an in der Keimbahn kodierten Rezeptoren, die so genannten pattern recognition receptors (PRRs), erkannt. Neben der Unterscheidung von körpereigenen und körperfremden Strukturen nimmt das angeborenen Immunsystem eine weitere, feinere Unterscheidung der detektierten Strukturen vor. So konnte gezeigt werden, dass murine Phagozyten lebende von toten Bakterien unterscheiden können, unabhängig von Replikation und dem Vorhandensein von Viruzlenzfaktoren. Die vorliegende Arbeit analysiert systematisch die Fähigkeit humaner, primärer Phagozyten zwischen lebenden und toten Bakterien zu unterscheiden sowie die sich daraus ergebenden immunologischen Konsequenzen. Im Gegensatz zu den Beobachtungen mit murinen Phagozyten produzierten humane Zellen geringe Mengen an Interferon-β (IFN-β) in Antwort auf lebende und tote Bakterien. Humane Zellen induzierten hingegen Tumornekrosefaktor (TNF) α selektiv nach Detektion lebender Bakterien, welches murine Zellen unabhängig von bakterieller Vitalität produzieren. Wie murine Zellen, sezernierten humane Zellen biologisch aktives Interleukin (IL)-1β nur nach Detektion lebender Bakterien. Mit Hilfe von pharmakologischen Inhibitoren und shRNA-vermittelten Gen-silencing mittels lentiviraler Transduktion, konnte eine Dichotomie in den Signalwegen der Zytokinantwort humaner Phagozyten gezeigt werden. Die Detektion lebender Bakterien induzierte die Produktion von IL-1β und TNFα durch CD14+CD16- Monozyten bzw. von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen über zwei scheinbar separate Signalwege. Die Produktion des prozessierten, biologisch wirksamen IL-1 β setzte das Vorhandensein von NLR Family Pyrin Domain Containing 3 (NLRP3) und Apoptosis-associated speck- like protein containing a CARD (ASC) voraus, und hing zumindest teilweise vom Signaladaptormolekül adaptor TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF), Toll like receptor (TLR)-4 und Bruton’s tyrosine kinase (BTK) ab. Im Gegensatz dazu zeigte sich die Produktion von TNFα abhängig von TLR8 and Phosphoinositide 3-kinase (PI3K). Ähnlich zu murinen Zellen erfordert die Bakterien-induzierte Produktion von IFN-β durch humane Zellen TLR4 und TRIF. Die vorliegenden Daten zeigen die Fähigkeit humaner Phagozyten lebende und tote Bakterien zu detektieren und mit einer differenzierten Immunantwort zu reagieren. Ferner beleuchtet die Studie die notwendigen Signalwege zum Erkennen von vita-PAMPs durch humane Phagozyten. Diese Erkenntnisse liefern einen wichtigen Beitrag zu unserem Verständnis von Wirt-Pathogen-Interaktionen und zeigen mögliche Zielmoleküle für Impfstoffadujuvantien oder Wirt- zentrierte Immunotherapeutika auf.

The innate immune system serves as the host’s first line of defense against microbial invasion. Per definitionem, all microbes contain highly conserved molecular structures termed pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). PAMPs are sensed by innate immune cells through a vast array of germ-line encoded receptors, called pattern recognition receptors (PRRs). Beyond the discrimination between ‘self’ and ‘non-self’ structures by PRR ligation, the innate immune system makes finer distinctions. It was previously shown that mouse phagocytes differentiate between viable and dead bacteria independently of replication or virulence factors. Bacterial viability is indicated by the presence of bacterial mRNA, which was previously identified as the first so- called ‘viability-associated-PAMP’ (vita-PAMP). The present study systematically analyzes the capacity of human primary phagocytes to distinguish viable from dead bacteria and the immunological consequences. In contrast to earlier observations in murine phagocytes, human cells produce low levels of interferon-β (IFN-β) in response to live but also dead bacteria. Instead, human cells selectively induced tumor necrosis factor α (TNFα) in response to live bacteria, which is independent of bacterial viability in mice. As in murine cells, the release of mature Interleukin (IL)-1β was induced only upon detection of viable bacteria. Using pharmacological inhibitors as well as lentivirally transduced shRNA-mediated gene silencing, we observed a dichotomous signaling pattern of cytokine production in response to live Escherichia coli. In CD14+CD16- monocytes or monocyte-derived dendritic cells, respectively, the recognition of bacterial viability differentially drives IL-1β and TNFα responses via two seemingly separate signaling pathways. Production of mature IL-1β required NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), and Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC), and was at least partially dependent on the signaling adaptor TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF), Toll like receptor (TLR)-4, and Bruton’s tyrosine kinase (BTK). In contrast, TNFα production was largely dependent on TLR8 and Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling. Similar to murine cells, bacteria-induced IFN-β production required TLR4 and TRIF. These data demonstrate the capacity of human phagocytes to sense and differentially respond to live and dead bacteria. The study sheds lights on the signaling requirements for vita-PAMP-sensing in human phagocytes, and it highlights differences from and similarities to the murine system. The findings make an important contribution to our understanding of host-pathogen interaction in humans and provide potential molecular targets for vaccine adjuvants or host-directed adjuvant immunotherapies.