Identification of molecular mechanisms of Wnt11 non-canonical signaling in regulation of L-type calcium channel

Abstract

The L-Type calcium channel (LTCC) is a heteromultimeric protein complex with an important function in cardiac biology since it ensures the main entry path for calcium into the cardiomyocytes. Its conductance increases during membrane depolarization, whereas decreases during calcium- and voltage-dependent inactivation. In addition, G protein-coupled receptor (GPCR) signaling provides a further regulatory layer for fine-tuning the LTCC (Catterall, 2000; van der Heyden et al., 2005). The α1C subunit is the main pore forming subunit of the LTCC, which is expressed at high levels in cardiomyocytes and is encoded by the CACNA1C gene (Weiss et al., 2013). It comprises of a cytosolic N- and C-terminal tails and four transmembrane domains, which harbor the ion-selective pore, voltage sensor and gating machinery (Carafoli et al., 2001). Its C-terminal tail (CT) serves as a scaffold for channel modulating molecules downstream of the GPCR signaling, including kinases and phosphatases (Catterall, 2000). Over the past few decades the LTCC regulation via β-AR/Gs protein systems was well demonstrated. However, little attention has been paid to its regulation via alternative GPCR-like systems such as Wnt11/Calcium pathway (Panáková et al., 2010). The present study provides evidence that Wnt11 signaling regulates the LTCC, hence the electrical gradient formation in developing zebrafish heart. I showed that loss of WNT11 induces the generation of a CT isoform in A-kinase anchoring protein (AKAP) anchored Protein kinase A (PKA) signaling dependent manner. Systematic analysis of all the AKAP candidates revealed that PKA targeting through AKAP2 to the CT plays a pivotal role in this isoform formation. In developing zebrafish heart Akap2 is indispensable for the proper heart looping and regulates the LTCC localization and abundance. In cooperation with the Wnt11 pathway it establishes the electrical gradient formation, since loss of akap2 rescued the abnormal cell coupling in wnt11-deficient hearts. These findings provide evidence that Wnt11 signaling compartmentalizes LTCC conductance by targeting PKA/AKAP2 required for the proper formation of intercellular cell coupling.

Der L-Typ-Calciumkanal (LTCC) ist ein heteromultimerer Proteinkomplex mit einer wichtigen Funktion in der kardiovaskulären Biologie, da dieser die hauptsächliche Eintrittsmöglichkeit von Calcium in Herzmuskelzellen sicherstellt. Die Leitfähigkeit des LTCC steigt während der Membrandepolarisation und sinkt während der Calcium- oder Spannungsabhängigen Inaktivierung. Darüber hinaus stellt der G Protein-gekoppelte Rezeptor (GPCR) Signalweg eine weitere regulatorische Ebene zur Feinjustierung des LTCC dar (Catterall, 2000; M. a G. van der Heyden, Wijnhoven, & Opthof, 2005). Die α1C Untereinheit ist hauptursächlich für die Porenbildung des LTCC, wird in großen Mengen in Herzmuskelzellen exprimiert und vom CACNA1C Gen kodiert (Weiss et al., 2013). Die α1C Untereinheit umfasst einen zytosolischen N- und C-terminalen Schwanz und vier Transmembrandomänen, welche die ionenselektive Pore, den Spannungssensor und die Gating-Maschinerie beherbergen (Carafoli et al., 2001). Sein C-terminaler Schwanz (CT) dient als Gerüst für kanalmodulierende Moleküle stromabwärts des GPCR-Signalwegs, einschließlich Kinasen und Phosphatasen (Catterall, 2000). In den letzten Jahren wurde die Regulation des LTCC durch das β-AR/Gs Proteinsystem ausführlich bewiesen. Jedoch ist der Regulation durch das alternative GPCR-ähnliche System, wie dem Wnt11/Calcium Signalweg, dabei wenig Aufmerksamkeit zugekommen (Panáková et al., 2010). Die vorliegende Studie erbringt Nachweise, dass der Wnt11-Signalweg den LTCC reguliert, und damit einhergehend die elektrische Gradientenbildung im sich entwickelnden Zebrafisch Herz. Ich habe gezeigt, dass der Verlust von WNT11 zur Erzeugung einer CT Isoform führt, abhänging von der A-Kinase Ankerprotein (AKAP)-verankerte Protein Kinase A (PKA)-Signalgebung. Eine systematische Analyse aller AKAP-Kandidaten ergab, dass PKA über AKAP2 auf den CT abzielt und so eine entscheidende Rolle bei der Bildung dieser Isoform spielt. Im sich entwickelnden Zebrafischherzen ist Akap2 unentbehrlich für das Looping des Herzens und reguliert die Lokalisation sowie Häufigkeit des LTCC. Zusammen mit dem Wnt11-Signalweg wird die elektrische Gradientenbildung etabliert, da der Verlust von akap2 die abweichende Zellkopplung in wnt11-defizienten Herzen wiederherstellt. Diese Erkenntnisse erbringen den Beweis dafür, dass der Wnt11-Signalweg die Leitfähigkeit des LTCC kompartmentalisiert, indem er auf die AKAP2/PKA-Interaktion abzielt, welche für die korrekte Bildung der interzellulären Kopplung benötigt wird.