Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine autosomal dominant vererbte Multiorganerkrankung, die schätzungsweise bei einem Kind von 2500-3000 Geburten auftritt. Das Krankheitsbild eines NF1 Patienten ist gekennzeichnet durch Hautveränderungen, den sog. Café-au-lait-Flecken sowie subkutanen und plexiformen Neurofibromen. Zusätzliche Symptome sind Lisch-Knötchen in den Augen, mentale Retardierung und Epilepsieanfälle. Spezifische Ver-änderungen des muskuloskelettale Systems sind Kleinwuchs, Skoliose, Pseudarthrose, Osteo- porose, tibiale Dysplasie sowie eine verminderte Muskelkraft. Das krankheitsverursachende NF1 Gen lokalisiert auf Chromosom 17 und kodiert das kleine GTPase aktivierende Protein Neurofibromin, welches eine Funktion als Tumorsuppressor ausübt. Vererbte als auch de novo Mutationen im NF1 Gen führen zu einem nicht-funktionsfähigen Protein, einer Hyperaktivierung des p21 RAS Proteins und einem dysregulierten Zellteilungsverhalten durch Aktivierung der RAS/MAPK-Signalkaskade. Das Ziel der Dissertation war die funktionelle Charakterisierung von Neurofibromin in der Entwicklung des muskuloskelettalen Systems. Dafür wurde ein konditionelles Knockout Maussystems etabliert, in dem Nf1 in undifferenzierten mesenchymalen Vorläuferzellen der sich entwickelnden Extremitäten inaktiviert wurde (Nf1Prx1). Der daraus resultierende Nf1Prx1 Mausphänotyp wurde hinsichtlich seines muskuloskelettalen Phänotyps charakterisiert. Die Nf1Prx1 Mäuse waren kleiner und die Skelettelemente in ihrer Größe reduziert. Histolo-gische Untersuchungen, Genexpressionsstudien und in vivo Analysen belegten, dass in Folge der Aktivierung der RAS/MAPK- Signaltransduktion die Chondrozytenproliferation verringert war und die Chondrozytenzonen in der Wachstumsfuge verkürzt vorlagen. Das wohl auffälligste Merkmal neugeborener Nf1Prx1 Mausmutanten waren die fusionierten Hüftgelenke, wodurch die Hinterläufe hinterhergezogen wurden und eine normale Fortbewe-gung verhindert wurde. Dieser Phänotyp entstand in der pränatalen Entwicklung durch die gestörte Ausbildung eines Gelenkspalts, welcher normalerweise zwischen den Entwicklungs-stadien E13.5 und E14.5 gebildet wird. Anhand einer durchgängigen Col2a1 Genexpression und einem persistent nukleär lokalisiertem SOX9 Protein konnte gezeigt werden, dass die Zellen des Gelenkspalts weiterhin chondrogenen Charakter besaßen und demnach die Knor- pelelemente von Pelvis und Femur miteinander verschmolzen blieben. Auch andere Gelenke wie Ellenbogen- und Kniegelenk waren in der Nf1Prx1 Maus deformiert. Histologische Analy-sen prä- und postnataler Entwicklungsstadien zeigten, dass dieser Defekt auf einen zuneh-menden Degradationsprozess in der postnatalen Entwicklung zurückzuführen ist. Die chondrozytenspezifische Ablation von Nf1 in einem weiteren Mausmodell (Nf1Col2) führte hingegen nicht zu einem Gelenkphänotyp. Zusätzlich zu den Skelett-Abnormalitäten zeigten Nf1Prx1 Mutanten starke Veränderungen des Muskelapparates. Am Beispiel des M.triceps konnte demonstriert werden, dass der Muskel kleiner war, die Anzahl an Muskelfasern pro Muskel reduziert und der Anteil an Fett- und Bindegewebe im Muskel dramatisch erhöht war. Damit ging eine verringerte Zugkraft der Vorderextremitäten der Mäuse einher. Um zu prüfen, ob der Muskelphänotyp auf einen prä-natalen Entwicklungsdefekt zurückzuführen ist, wurden die einzelnen Phasen der Myogenese näher betrachtet. Immunhistochemische Analysen der frühen Myogenese demonstrierten, dass weder Migrations- noch Proliferationsprozess der Muskelvorläuferzellen in den Nf1Prx1 Mausmutanten betroffen waren. Hingegen konnte anhand der verminderten Genexpressionen von Markern der Muskeldifferenzierung wie Myogenin und MyoD ein Muskeldifferenzie-rungsdefekt in der Nf1Prx1 Mutante gezeigt werden. Zudem war die Proliferationsrate der Myoblasten erhöht und das MYOD Protein vornehmlich nukleär in den Muskelfibrillen loka-lisiert. Zusammenfassend ist zu konstatieren, dass Neurofibromin in verschiedenen Aspekten der muskuloskelettelen Entwicklung eine wichtige Rolle spielt. Die Inaktivierung von Nf1 resul-tiert in einem Muskel- und Gelenkphänotyp und läßt damit auf einen direkten Zusammenhang in der Entwicklung der einzelnen Komponenten des muskuloskelettalen Systems schliessen. Das Nf1Prx1 Mausmodell eignet sich als Modellsystem für die humane NF1 Erkrankung, da es wichtige Aspekte des humanen muskuloskelettalen NF1 Phänotyps rekapituliert und damit das Entschlüsseln des Pathomechanismus ermöglicht.
Neurofibromatosis Type 1 (NF1) is a tumor predisposition syndrome. It is inherited in an au-tosomal dominant manner and affects 1 in 2500-3000 individuals. NF1 is mainly characterized by the occurrence of pigmented skin lesions (café-au-lait spots) and the formation of neurofi-bromas along central and peripheral nerves. In addition to that, patients suffer from iris Lisch nodules, mental retardation, learning disabilities and epilepsy. Furthermore, NF1 patients show musculoskeletal lesions such as short stature, scoliosis, pseudarthrosis, osteoporosis, tibial dysplasia and a diminished muscle force. The affected gene Neurofibromin 1 (NF1) is located on Chromosom 17. The protein negative-ly regulates a key signal transduction protein called p21 RAS. Thus, loss of NF1 activity is expected to lead to the inability to shut off activated p21 RAS with subsequent aberrant growth promoting signals. In this work I was able to establish a conditional inactivation approach to ablate Nf1 function specifically in the early undifferentiated cells of the developing limbs. Loss of Neurofibromin leads to a severe musculoskeletal phenotype (Nf1Prx1). Inactivation of Nf1 resulted in short stature and mice exhibited congenital limb shortening. Measurements of bone growth, histology, gene expression profiling and in vivo analysis re-vealed diminished chondrocyte proliferation and a differentiation defect due to the activation of RAS/MAPK signaling. Newborn Nf1Prx1 mice were easily recognized at birth due to their inability to bend their hind limbs at the hip joint. Examinations displayed cartilaginous fusions of the hip joints. This phenotype resulted from a lack of joint cavity initiation caused by an impaired chondrocyte de- differentiation in the presumptive joint region. This was shown by a continous expression pattern of Col2a1, a reduced Gdf5 expression and a nuclear SOX9 localization persisted in all cells of the cartilage anlage in Nf1Prx1 mice. Elbow and knee joint were severely deformed, too. Histological analysis indicated a postnatal degradation process of elbow and knee joint. In contrast to that, chondrocyte specific inactivation of Nf1 did not lead to fused and mis-shaped joints. Furthermore, loss of Nf1 resulted in a muscle phenotype. In M. triceps, for ex-ample, muscle size was reduced, number of muscle fibers diminished but connective tissue and fat was dramatically increased in the mutant muscle. Nf1Prx1 mice had also diminished grip strength. Detailed analysis of myogenesis revealed no differences in migration and early proliferation of muscle precursors in the mutant mice. In contrast, gene expression of muscle differentiation markers Myogenin and MyoD was reduced. Besides myoblast proliferation was increased and MYOD protein primarily localized in the nuclei of Desmin positive muscle fibres. These results proposed a defect in differentiation of Nf1Prx1 muscles. In fact, Nf1 has essential multiple roles in skeletal and muscle development and therefore promotes assumptions on a direct developmental relation of musculoskeletal components. Nf1Prx1 mouse model recapitulates the human musculoskeletal NF1 phenotype and can be used for understanding pathomechanism and the establishment of prospective therapy approaches.
