Molecular Mechanism and Function of Endocytic Sorting of Synaptotagmin 1 at Central Synapses

Abstract

Communication in the central nervous system relies on fast and precise neurotransmission at synapses. The arrival of an action potential at the presynapse triggers the calcium regulated exocytic fusion of synaptic vesicles (SVs). Exocytosis and neurotransmitter release are followed by local SV membrane retrieval and reformation of functional SVs with the correct size and protein composition that can replenish the SV pool and thereby maintain neurotransmission. In spite of decades of research many aspects of SV recycling remain unclear. In particular, the precise sorting of surface- stranded SV proteins during SV endocytosis as well as the coupling of SV exo- and endocytosis are still unknown. To address these open questions, we investigated whether the endocytic sorting of synaptotagmin 1 (Syt1), the calcium sensor for SV exocytosis, is ensured by two mechanisms in mammals: by a dedicated endocytic adaptor as well as by complex formation with another SV protein. Further, we examined the functional consequences of Syt1 sorting in mammalian synapses. I could show that endocytic sorting and maintenance of Syt1 at mammalian synapses is mediated by overlapping activities of stonin 2 (Stn2) and the SV glycoprotein SV2A/B. Deletion or knockdown of either SV2A/B or Stn2 resulted in partial Syt1 loss and missorting of Syt1 to the neuronal surface in brain slices and hippocampal neurons in culture. Combined deletion of both SV2A/B and Stn2 dramatically aggravated this phenotype. The repartitioning of Syt1 to the neuronal plasma membrane is dependent on neuronal activity and led to a partial loss of Syt1 from recycling SVs. Consequently, the defective Syt1 sorting to SVs in the absence of SV2A/B and Stn2 impaired basal neurotransmission. These results suggest that SV2A/B and Stn2 share an overlapping function in mediating endocytic sorting of Syt1 to SVs at mammalian synapses and favor a model according to which SV protein sorting is guarded by both cargo-specific endocytic adaptors as well as complex formation of SV proteins. Interestingly, we found that deletion of the Syt1 sorting adaptors Stn2 and SV2A/B accelerated endocytic retrieval and facilitated SV exocytosis in response to repetitive electrical stimulation in hippocampal neurons. The surface-stranding of Syt1 in the absence of Stn2 and the augmented SV exo- and endocytosis correlated with elevated presynaptic levels of phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate [PI(4,5)P2], a membrane phospholipid essential for SV exocytic fusion and endocytic retrieval. In contrast, the levels of another plasma membrane residing phosphoinositide, PI(4)P, remained unchanged. Increased presynaptic PI(4,5)P2 levels likely are caused by the direct association of Syt1 with phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase type I (PIPK1γ), the major PI(4,5)P2-synthesizing enzyme at synapses. Indeed, superresolution nanoscopy revealed a selective relocalization of PIPK1γ towards the plasma membrane in Stn2 depleted and thus Syt1 surface-enriched neurons. Taken together, my data suggest that Syt1 at the axonal surface triggers the recruitment of PIPK1γ to facilitate local PI(4,5)P2 synthesis at or near release sites and couples thereby PI(4,5)P2-dependent SV exo- and endocytosis.

Die Kommunikation im zentralen Nervensystem basiert auf einer schnellen und präzisen Erregungsübertragung an Synapsen. Sobald ein Aktionspotential die Präsynapse erreicht, löst es die Kalzium-regulierte Verschmelzung synaptischer Vesikel (SV) an der aktiven Zone aus. Die Exozytose und Freisetzung von Neurotransmittern folgt die Rückgewinnung der fusionierten Membran und Bildung neuer funktionaler SV, welche wieder die richtige Größe und vor allem die korrekte Proteinzusammensetzung aufweisen müssen, um die fusionierten SV zu ersetzen. Dies ist notwendig, um lang anhaltende Neurotransmission sicher zu stellen. Trotz jahrelanger intensiver Forschung sind viele Aspekte dieses Recyclings der SV nicht geklärt. Besonders, die präzise Sortierung während der Endozytose von an der Oberfläche zurückgebliebenen SV Proteine sowie die Kopplung von Exo- und Endozytose sind noch immer unbekannt. Um diese offenen Fragen zu beantworten, haben wir untersucht, ob die Sortierung von Synaptotagmin 1 (Syt1), dem Kalzium-Sensor für die SV Fusion, in Säugetieren durch zwei Mechanismen sichergestellt wird: durch einen spezifischen, endozytotischen Adaptor sowohl als auch durch Komplexbildung mit einem weiteren SV Protein. Darüber hinaus haben wir die funktionalen Konsequenzen von der Syt1-Sortierung in Säugetiersynapsen erforscht. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass die Sortierung während der Endozytose sowie die Erhaltung von Syt1 durch überlappende Funktionen von dem spezifischen Adaptor stonin 2 (Stn2) und dem SV Protein SV2A/B in der Säugetiersynapse gewährleistet werden. Das Fehlen von SV2A/B oder Stn2 führte zu einem partiellen Verlust von Syt1, einhergehend mit der Akkumulation von Syt1 an der Zelloberfläche von Neuronen in Gehirnschnitten und in hippocampalen neuronalen Kulturen. Die Abwesenheit beider Proteine, Stn2 und SV2A/B, verstärkte diesen Phänotyp dramatisch. Zusätzlich konnte ich bestätigen, dass die Umverteilung von Syt1 zur Zelloberfäche von neuronaler Aktivität abhängig und für den Verlust von vesikulärem Syt1 verantwortlich ist. Die mangelnde Präzision der Syt1-Sortierung führte folglich zu einer stark eingeschränkten Neurotransmission. Diese Ergebnisse weisen daher auf überlappende Aktivitäten von Stn2 und SV2A/B in der Säugetiersynapse hin, um Syt1 in SV zu sortieren. Weiterhin lassen die Daten darauf schließen, dass die SV Protein Sortierung mit Hilfe zweier Mechanismen sichergestellt wird: einerseits durch spezifische Adaptoren, andererseits durch die Assoziation von SV Proteinen miteinander. Überraschenderweise beschleunigt die Abwesenheit der Syt1-Sortierungsproteine SV2A/B und Stn2 sogar die Aufnahme der SV Proteine und verstärkt zudem die SV Exozytose, wenn hippocampale Neurone repetitiv elektrisch stimuliert werden. Die Akkumulation von Syt1 an der neuronalen Zelloberfläche korreliert nicht nur mit der gesteigerten SV Exo- und Endozytose, sondern auch mit erhöhten präsynaptischen Konzentrationen von Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat [PI(4,5)P2]. PI(4,5)P2 gehört zu den Phospholipiden und ist essentiell für die Fusion von SV und deren Rückgewinnung. Im Gegensatz dazu sind die Level von PI(4)P, einem weiteren Phosphoinositid, das auf der Plasmamembran lokalisiert ist, unverändert. Die erhöhten Level von PI(4,5)P2 lassen sich vermutlich durch eine direkte Assoziation von Syt1 mit der Phosphatidylinositol 4-phosphat 5-kinase Typ I (PIPK1γ) erklären, die hauptsächlich für die Synthese von PI(4,5)P2 verantwortlich ist. Zudem bestätigt hoch-auflösende Mikroskopie eine veränderte Lokalisierung von PIPK1γ an die Plasmamembran von Neuronen, welche Stn2 defizient sind und somit an der Oberfläche angereichertes Syt1 aufweisen. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass die Akkumulation von Syt1 an der Plasmamembran die Rekrutierung von PIPK1γ fördert und damit die lokale Synthese von PI(4,5)P2 an oder nahe der aktiven Zone ermöglicht. Somit koppelt Syt1 die PI(4,5)P2 abhängige SV Exo- und Endozytose.