PIM-Signalnetzwerk bei Zelllinien diffuser großzelliger B-Zell-Lymphome

Abstract

Das diffuse großzellige B-Zell- Lymphom (DLBCL) stellt das häufigste auftretende Non-Hodgkin Lymphom dar. Es zählt zu den hochmalignen Lymphomen und lässt sich durch Genexpressionsanalysen in Subgruppen mit unterschiedlichen Prognosen einteilen. Die Frage nach dem unterschiedliche Therapieansprechen zwischen den DLBCL-Untergruppen activated B-cell-like (ABC) und germinal center B-cell-like (GCB) ist trotz weitreichender Forschung noch nicht vollständig geklärt. PIM-Inhibitoren zeigen bei hämatologischen Erkrankungen vielversprechende Ergebnisse. Mit dem Einsatz von LGB321, einem PIM-Inhibitor, sollen diese bei DLBCL untersucht werden. RAD001, ein mTOR- Inhibitor, wird bereits in Studien bei DLBCL eingesetzt und Rituximab, ein anti-CD20-Antikörper, ist ein etablierter Vertreter der Immuntherapie bei DLBCL. DLBCL-Zellinien beider Untergruppen sowie primäre Zellen eines Patienten mit DLBCL wurden mit LGB321, RAD001 und Rituximab einzeln und in Kombination behandelt. Eine Gemeinsamkeit der dabei untersuchten Signalwegkaskaden ist ihr Einfluss auf den Translationsinitationskomplex eIF- 4F und hierüber die Regulation der cap-abhängigen mRNA-Translation. Die gleichzeitige Hemmung verschiedener Signalwege, die eine gemeinsame Endstrecke haben und darüber die Translationsinitationskomplexbildung vermindern könnten, steigert möglicherweise die Effekte einer Einzelinhibition. Das Erliegen der cap-abhängigen mRNA-Translation könnte induziert werden und somit Verhinderung von Tumorwachstum. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PIM- Inhibitoren zu einer Proliferationsinhibition führen. Durch die Kombination des PIM-Inhibitors mit RAD001 und Rituximab ließen sich in Zellproliferationsassays verstärkte Inhibitionseffekte sowohl bei Zelllinien als auch bei primären Zellen zeigen. Auf der Suche nach den beteiligten Mechanismen wurden eine ABC-Zelllinie, Riva, und eine GCB-Zelllinie, SU-DHL4, auf Zellzyklusveränderungen, Autophagie und vermehrte Apoptose untersucht. Die Kombination führte bei beiden Zelllinien zu einem Anstieg der toten Zellen und bei SU-DHL4 zusätzlich zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die behandelten Zellen zeigten hingegen keine Zunahme der Autopaghie. Bei Riva ließ sich, eingeleitet über Caspase 9, eine Apoptoseinduktion bei der Behandlung mit den Substanzen nachweisen. Die Apoptoseinduktion wurde auch bei SU-DHL4 sichtbar, jedoch zeigte sich hier eine Abhängigkeit in Bezug auf den Einsatz von Rituximab. In beiden Zelllinien induzierte die Dreifachkombination eine Herunterregulation des Schlüsselproteins der drei untersuchten Signalwegkaskaden, p-4EB-P1. Unter der Arbeitshypothese, dass hierdurch die Komplexbildung des weiter distal liegenden eIF-4F verhindert werden kann, erfolgte dessen Analyse. Durch den gemeinsamen Einsatz von LGB321 und RAD001 konnte die Komplexbildung gehemmt werden, einen Vorteil durch die Hinzugabe von Rituximab ergab sich nicht. Als Indikator für Auswirkungen auf die cap- abhängige mRNA-Translation zeigte sich eine durch die Dreifachkombination in beiden Zelllinien induzierte verminderte Expression von Mcl-1 und c-Myc. Diese Erkenntnisse könnten als Grundlage für weiterführende Analysen mit Kombinationstherapien zur Herunterregulation der cap-abhängigen mRNA- Translation als Behandlungsansatz bei DLBCL dienen.

Diffuse large B-cell lymphoma is the most frequently occurring non-Hodgkin´s lymphoma. It´s a high-grade lymphoma that can be divided into subtypes with distinct prognosis by gene-expression profiling. To date, it remains unclear why the subtypes ABC and GCB respond differently to standard chemotherapy. PIM inhibitors have provided encouraging results for hematologic malignancies. The capacity of a PIM inhibitor, LGB321, in DLBCL remains to be demonstrated. RAD001, a mTOR inhibitor, has been used in several studies investigating DLBCL. Rituximab, an anti-CD20 antibody, is an established component of immunotherapy in DLBCL. DLBCL cell lines of both subtypes as well as primary cells of a patient with DLBCL were treated with LGB321, RAD001 and Rituximab as single agents and in combination. The PI3K/AKT/mTOR-, PIM- and ERK- signaling pathways share molecular targets like the activators of cap dependent mRNA-translation and influence the formation of the translation initiation complex eIF-4F. Hypothetically, combining the three agents cause a stronger suppression of the formation of eIF-4F than a single agent. A combined treatment might induce down-regulation of the cap dependent translation and prevention of cancer progress. This work revealed that PIM- inhibitors reduced proliferation. Moreover, combining the three agents had a stronger inhibiting effect in both DLBCL cell lines and primary cells. The impact on cell cycle, autophagy and apoptosis induction was further analyzed using a cell line from the ABC subtype (Riva) and from the GCB subtype (SU- DHL4). The triple combination induced an increase in cell death in both cell lines. In SU-DHL4 this was associated with G1 cell-cycle arrest. No increase of autophagy was observed in either cell line. Riva showed an induction of apoptosis via caspase 9 activation after the triple treatment. The induction of apoptosis was also observed in SU-DHL4, but this was linked to the use of Rituximab. In both cell lines the combined treatment induced a down-regulation of the key protein of the signaling pathways, p-4EB-P1. When assuming that this reduces the formation of eIF-4E, the complex was analysed subsequently. The formation of eIF-4F was suppressed when combining LGB321 and RAD001, there was no benefit of adding Rituximab. As a possible effect on the cap dependent mRNA-translation the combination induced a reduced expression of Mcl-1 and c-Myc in both cell lines. This might be a reason why there should be more studies with combined therapies regarding the down-regulation of the cap dependent translation as a therapeutic approach for treating DLBCL.