Structural and Functional Studies on Bacterial Cold Shock Proteins: Nucleic-Acid Binding, the Architecture of a Domain Swap, and Mechanisms Contributing to their Stabilization.

Abstract

The bacterial cold shock proteins (CSP) are essential players in bacterial cold shock response. These small proteins (65 - 70 amino acids) bind single- stranded nucleic acids with micromolar to nanomolar KD values. Functions ascribed to CSP include roles as RNA chaperones and in transcription antitermination. This dissertation aims at structural and functional studies of cold shock proteins for a better understanding of CSP function on the molecular level as well as in biological contexts.

In the first part (Chapter 3), CSP of Bacillus subtilis and Bacillus caldolyticus in complex with oligonucleotides are analyzed using X-ray crystallography and further biophysical methods. In both complex structures the ligands adopt irregular extended single-stranded conformations. Their nucleobases interact with protein groups through extensive stacking interactions and some polar contacts, while their sugarphosphate backbones are solvent exposed. The molecular composition of the CSP ligand-interaction surfaces allows them to bind thymine-based deoxyriboheptanucleotides. Uridine- based ribonucleotides are expected to be bound with a similar binding mode without additional interactions. In-solution binding studies confirm the binding mode observed in the crystal structures and demonstrate that both CSP preferentially bind to thymine-rich heptanucleotides. Comparisons of the complex structures with ligand-free crystal structures indicate, that the binding interface is already preformed in the absence of a ligand. The high degree of conservation of the binding interface in sequences of other CSP and the related eukaryotic Y-box proteins suggests, that these proteins do not only have a common ancestor but also share a common mode of ligand binding and display similar binding preferences.

In the second part (Chapter 4), the structural plasticity of the cold shock domain architecture is evaluated, by comparing the structure of a CSP domain- swapped dimer to closed-monomeric structures of CSP. The swap is enabled by a strictly localized change of the peptide plane linking Glu36-Gly37 in loop L34, which causes the protein chain to relocate by an effective 180° rotation at this position. In this conformation the first three β-strands of one chain associate with strands 4 and 5 from another chain to form a globular β-barrel and vice versa. Interestingly, closed monomeric structures display a two-state conformational variability at the position where the domain swap is observed.

In the last part (Chapter 5), two variants of Bacillus subtilis CspB which feature five stabilizing mutations, are analyzed structurally for effects contributing to their increased stability. These variants were generated by the PROSIDE in-vitro evolution method, which is based on phage display techniques. Their stabilizing effects result by large from optimized electrostatic interactions, which resemble stabilizing contributions in a naturally occurring CSP from the thermophilic bacterium Bacillus caldolyticus. The high prevalence of certain mutations derived from PROSIDE selections in sequences of natural CSP representatives suggests, that these residues may impart stability in several natural CSP.

Die bakteriellen Kälteschockproteine (cold shock proteins - CSP) sind ein wesentlicher Bestandteil der bakteriellen Kälteschockantwort. Diese kleinen, 65-70 Aminosäuren umfassenden Proteine binden einzelsträngige Nukleinsäuren mit mikro- bis nanomolaren KD Werten. Den Kälteschockproteinen werden unter anderem Funktionen als RNA Chaperone und als Transkriptions-Antiterminatoren zugeschrieben. Diese Dissertation beinhaltet strukturelle und funktionale Untersuchungen an Kälteschockproteinen, um das Verständnis in CSP Funktionen auf molekularer Ebene sowie im biologischen Kontext zu erweitern.

Im ersten Teil (Kapitel 3) werden CSP aus Bacillus subtilis und Bacillus caldolyticus im Komplex mit Oligonukleotiden mit Hilfe der Röntgenkristallographie und weiteren biophysikalischen Methoden untersucht. In beiden Komplexen nehmen die Liganden unregelmäßige und ausgedehnte einzelsträngige Konformationen ein. Ihre Nukleobasen interagieren mit Proteingruppen durch ausgedehnte Stapelwechselwirkungen und einige polare Kontakte, ihr Zuckerphosphatrückgrad ist hingegen solvensexponiert. Die molekulare Beschaffenheit der CSP Ligandeninteraktionsflächen ermöglicht die Bindung von thyminreichen DNA-Heptanukleotiden. Uridinreiche RNA- Heptanukleotide könnten ohne Ausbildung weiterer Wechselwirkungen auf ähnliche Weise mit CSP interagieren. Bindungsstudien in Lösung bestätigen den Bindungsmodus, der in den Kristallstrukturen beobachtet wird, und belegen, dass beide CSP präferentiell an thyminreiche Heptanukleotide binden. Der Vergleich der Komplexstrukturen mit CSP Kristallstrukturen ohne Liganden zeigt, dass die Bindungsstelle auch in Abwesenheit von Liganden vollständig ausgebildet vorliegt. Der hohe Grad der Konservierung dieses Bereichs in den Kälteschockproteinen und in den verwandten eukaryotischen Y-Box Proteinen deutet darauf hin, dass diese Proteine nicht nur von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen, sondern auch einen gemeinsamen Modus der Ligandenbindung und ähnliche Bindungspräferenzen aufweisen.

Im zweiten Teil (Kapitel 4) wird die strukturelle Plastizität der Kälteschockproteine untersucht. Hierzu wird die Kristallstruktur eines domänengetauschten Dimers mit Strukturen von geschlossen-monomeren Kälteschockproteinen verglichen. Der Domänenaustausch wird durch eine lokale Umlagerung einer Peptidebene vermittelt, welche die Aminosäuren Glu36 und Gly37 in Loop L34 verbindet, wodurch eine 180° Rotation der Peptidkette erreicht wird. In dieser Konformation assoziieren die ersten drei β-Stränge mit den β-Strängen 4 und 5 von einer weiteren Proteinkette unter Ausbildung eines globulären β-Fasses und umgekehrt. Interessanterweise wird an der Stelle des Domänenaustauschs in geschlossen-monomeren Strukturen von Kälteschockproteinen eine zweistufige konformationelle Variabilität beobachtet.

Im letzten Teil (Kapitel 5) werden zwei Varianten des CspB aus Bacillus subtilis, die 5 stabilisierende Mutationen tragen, strukturell nach Effekten untersucht, welche zu ihrer erhöhten Stabilität beitragen. Die Varianten waren mit der Methode der PROSIDE in-vitro Evolution erzeugt worden, die auf der Phage-Display Technik basiert. Die stabilisierenden Effekte lassen sich im wesentlichen auf optimierte elektrostatische Wechselwirkungen zurückführen und ähneln stabilisierenden Beiträgen in einem natürlich vorkommenden CSP des thermophilen Bakteriums Bacillus caldolyticus. Das häufige Vorkommen bestimmter stabilisierender Mutationen aus PROSIDE Selektionen in den Sequenzen von CSP Repräsentanten deutet darauf hin, dass diese Reste zur Stabilität von zahlreichen natürlichen CSP beitragen könnten.