dc.contributor.author
Eigenbrod, Karen Ylva Gertrud
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:06:36Z
dc.date.available
2006-01-17T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2063
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6265
dc.description
Deckblatt
Inhaltsverzeichnis
Einführung
5
Elektrophorese und das Paradebeispiel der Klonalität
9
Gensequenzen
12
das Spezies-Problem
15
Eigene Arbeiten
17
Material
17
Bakterienstämme
17
Nährmedien
19
Oligonukleotide
20
vorgefertigte Reagenzien
24
Methoden 26
Isolierung von Nukleinsäuren 26
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 28
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 30
Elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren 31
Hybridisierung 31
DNA-Sequenzanalyse 31
Computergestützte Datenanalyse - Datensatzanalyse 32
Eigene Ergebnisse 33
DNA-Sequenzanalyse 33
Sequenzlänge 33
Anzahl der Variationen bei den folgenden Stämmen 33
Housekeeping-Gene 34
PCR-Elektropherogramm (Beispielhaft für alle weiteren Gene) 35
Nachweis des cadB-Gens mittels Dot-Blot-Hybridisierung 36
Virulenzassoziierte Gene 37
Phylogenetische Analysen 44
Houskeeping-Gene 44
Virulenzassoziierte Gene 56
Diskussion 100
Zusammenfassung 114
Summary 116
Abbildungsverzeichnis 118
Tabellenverzeichnis 118
Nachweis der verwendeten Quellen 119
Danksagung 134
dc.description.abstract
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Multilocus-Sequenz-Typisierung
(MLST) die Verwandtschaftsverhältnisse von 25 bovinen Nicht-O157:H7
-Shigatoxin-bildenden Escherichia coli (STEC) -Stämmen bestimmt und mit einem
O157:H7-Stamm sowie dem E. coli K12-Referenzstamm MG1655 verglichen. Für die
phylogenetischen Untersuchungen wurden einerseits die vier Housekeeping-Gene
cadB (442 bp), mdh (810 bp), putP (483 bp) und trpC (420 bp) partiell
sequenzanalysiert. Weiterhin wurden Gene des über horizontalen Gentransfer
erworbenen Locus of Enterocyte Effacement (LEE) analysiert, und zwar die
hochvariablen Virulenzgene eae (895 bp) und espB (374 bp). Anhand der Daten
wurden Kladogramme erstellt, deren Vertrauenswürdigkeit durch eine kombinierte
Analyse in einem Maximum-Parsimonie-Baum (MPT) visualisiert wurde. Ziel der
Untersuchungen war es, die mögliche Entwicklungsgeschichte dieser LEE-
positiven bovinen STEC-Stämme nachzuzeichnen.
Die Analyse der Housekeeping-Gene erbrachte das Vorhandensein von
möglicherweise sechs verschiedenen Clustern. Eine endgültige Clusterbestimmung
hätte die Sequenzanalyse weiterer Housekeeping-Gene sowie einen größeren
Datensatz erfordert. Bezüglich der Virulenzgene stimmten die phylogenetischen
Daten der espB und eae-Gene weitestgehend überein, was als Hinweis auf deren
Co-Evolution gewertet wird. Weiterhin zeigte sich eine absolute Assoziation
zwischen den 8 verschiedenen nachgewiesenen Intimintypen und der
phylogenetischen Verwandtschaft der Stämme. Demnach kann das Intimin als
phylogenetischer Marker gewertet werden.
Die aus der Analyse der Housekeeping-Gene getroffene phylogenetische
Entwicklung der Stämme wurde weiterhin in Einklang gebracht mit den Daten der
LEE-assoziierten Gene, um einen möglichen Zeitpunkt der Übertragung des LEE
abschätzen zu können. Aufgrund der geringen Zahl untersuchter Gene konnte
keine endgültige Hypothese erstellt werden, allerdings sprechen die Daten eher
dafür, dass der LEE mehrfach und unabhängig voneinander in verschiedene E.
coli-Phylotypen inserierte. Nach Integration des LEE in das jeweilige E. coli-
Chromosom fand dann die jeweilige Weiterentwicklung des LEE statt, die anhand
der Gene eae und espB analysiert wurde. Die unterschiedlichen Entwicklungen
finden in den deutlichen Sequenzgrößen- und Sequenzfolgen-Unterschieden einen
klaren Ausdruck. Sie enthüllten Clusterbildungen bei den Housekeeping-Genen,
die durch unterschiedliche Mutationen über die Zeit entstanden sein müssen.
Daraus wird der Schluss gezogen, dass es sich um wenigstens fünf, mutmaßlich
jedoch sogar sechs, verschiedene Cluster handelt, die nur zum Teil die
Einteilung durch Whittam (Whittam, 1998) und Reid (Reid et al., 1999; Reid et
al., 2000), über die MLEE (Selander and Lewin, 1980; Selander et al., 1986)
bestätigen. Diese Cluster spiegeln sich auch in denen der Virulenzgene wieder,
so dass davon ausgegangen werden kann, dass es sich jeweils um eine
unabhängige Aufnahme eines LEE, aber unterschiedliche Weiterentwicklung seit
diesem Zeitpunkt handelt. Die deutlichsten Veränderungen, die sich am zeta-
Cluster zeigten, könnten auf einem relativ höheren Selektionsdruck beruhen,
oder aber auch einfach dadurch zustande gekommen sein, dass sie eine längere
Zeit der Entwicklung hatten, also schlichtweg älter sind. Diese Hypothesen
müssen in umfangreicheren zukünftigen Untersuchungen belegt bzw. widerlegt
werden.
Zur Darstellung einer Zeitskala fehlen geeignete sog. "Outgroups", so dass die
Trennungszeiten der einzelnen Klone nicht geschätzt werden können. Somit ist
auch keine Aussage darüber möglich, welcher Klon sich von welchem
Ursprungsklon zu welchem Zeitpunkt getrennt hat. Die Analysen deuten jedoch
darauf hin, dass der LEE mehrfach und zu unterschiedlichen Zeiten von den
einzelnen Klonen aufgenommen worden ist.
de
dc.description.abstract
This thesis describes the determination of the relationships between of 25
bovine non-O157:H7 Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains by
multilocus sequence typing (MLST) and compared with an O157:H7 strain and the
E. coli K12 reference strain MG1655. For the phyologenetic analyses the four
housekeeping genes cadB (442 bp), mdh (810 bp), putP (483 bp) and trpC (420
bp) were subjected to partial sequence analysis. Genes of the locus of
enterocyte effacement (LEE) acquired by horizontal gene transfer, i.e. the
highly variable virulence genes eae (895 bp) and espB (275 bp) were also
analysed. Cladograms were established on the basis of the data obtained. The
reliability of the cladograms was visualised by means of a combined analysis
in a maximum parsimony tree (MPT). The aim of the investigations was to trace
the possible developmental history of these LEE-positive bovine STEC strains.
The analysis of the housekeeping genes revealed the presence of possibly six
different clusters. Sequence analysis of further housekeeping genes and a
larger amount of data would have been necessary to arrive a final
determination of the clusters. As regards the virulence genes, the
phylogenetic data on the espB were more or less the same as those of the eae
gene, which can be taken as an indication of their co-evolution. There was
also an absolute association between the 8 different types of intimin
identified and the phylogenetic relationships between the strains. Intimin can
thus be considered to be a phylogenetic marker.
The phylogenetic development of the strains as established by the analysis of
the housekeeping genes was also compared with the data on the LEE-associated
genes, in order to be able to estimate the time at which the LEE may have been
transferred. Owing to the small number of genes investingated it was not
possible to arrive at a final hypothesis, however, from the data it would
appear that the LEEs were inserted several times in different E. coli
phylotypes, independently of each other. The further development of the
respective LEEs took place following integration of the LEE in the respective
E. coli chromosomes and they were then analysed separately for the genes eae
and espB. The differences between their developments are clearly reflected in
the pronounced differences in sequence size and sequence order. Thus, they
revealed the formation of clusters of the housekeeping genes which must have
developed as a result of different mutations over time. This led to the
conclusion that there are at least five, probably even six different clusters
which only partly confirm the serotypes established by Wittam (Whittam, 1998)
and Reid (Reid et al., 1999; Reid et al., 2000) the aid of MLEE (Selander and
Lewin, 1980; Selander et al., 1986). These clusters are also reflected in the
virulence genes and it can thus be assumed that each strain inserts an LEE
independently of the others, but that its development takes a different course
from this time onwards. The most pronounced changes revealed in the zeta
cluster may have been attributable to a relatively higher selection pressure
or have come about purely because they needed longer to develop, i.e. were
simply older. More comprehensive research is needed to confirm or reject these
hypotheses.
The "outgroups" that would be required to represent a time scale do not exist
and it was thus not possible to estimate the separation times of the
individual clones. It is therefore also not possible to establish which clone
separated from which progenitor clone at which point in time. However, the
results of the analyses indicate that the LEE was inserted by the individual
clones at several different times.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Escherichia coli
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Untersuchungen zur Evolution von nicht-O157-STEC-Stämmen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Lothar H. Wieler
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Hanns Ludwig
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ernst Hellmann
dc.date.accepted
2004-04-01
dc.date.embargoEnd
2006-01-19
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2006000220
dc.title.translated
Investigations for the evolution of not-O157-STEC-trunks
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000002058
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2006/22/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000002058
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access