Charakterisierung der Glykosylierungsstelle von Glykoproteinen mittels Matrix- unterstützter Laserdesorption / Ionisations- (MALDI) und Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS)

Abstract

Die Glykosylierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die die biologische Aktivität von Proteinen wesentlich beeinflusst. Sie ist ortsspezifisch und abhängig von der sterischen Hinderung um die Glykosylierungsstellen und den vorhandenen Glycosyltransferasen. Humanes Alpha-1-Antitrypsin (A1AT) ist ein bekanntes Glykoprotein mit Antiprotease- Aktivität. Das Protein A1AT besitzt 394 Aminosäuren und drei potentielle N-Glykosylierungsstellen an den Positionen Asn-46, Asn-83 und Asn-247. Ein A1AT-Mangel wird zur Zeit mit humanem A1AT aus dem Plasma behandelt. In Hinblick auf die therapeutischen Anwendungen wurde rA1AT in der neuen humanen neuronalen Zelllinie (AGE1.hn) und der human embryonic kidney 293 (HEK293) Zelllinie hergestellt. In der vorliegenden Arbeit wurden die N-Glykosylierung und die Glykosylierungsstelle von A1AT aus AGE1.hn-Zellen und HEK293-Zellen sowie von den entsprechenden A1AT-Varianten aus HEK293-Zellen massenspektrometrisch analysiert. Die Glykopeptide wurden mit der zwitterionischen hydrophilen Interaktionsflüssigkeitschromatographie (ZIC- HILIC) angereichert und mittels nano-RPLC-MS/MS analysiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass A1AT aus der AGE1.hn Zelllinie Asn-247 größtenteils biantennäre fucosylierte N-Glykane besitzt, während die Glykosylierungsstelle Asn-46 triantennäre Glykane trägt. Asn-83 besitzt überwiegend fucosylierte tri- und tetraantennäre Glykane. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die verwendeten Zelllinien (AGE1.hn und HEK293) zur Produktion der A1AT einen entscheidenden Einfluss auf die Kohlenhydratseitenketten des Glykoproteins haben. Die neuen A1AT-Varianten N123 und N201 aus der HEK293-Zelllinie wurden mit einzelnen zusätzlichen N-Glykosylierungsstellen hergestellt. Das ortsspezifische Profil der A1AT- Variante N123 bestand vor allem aus monofucosylierten bi-, tri- und tetraantennären komplexen N-Glykanen mit einer Tendenz zu höheren Antennen- Strukturen im Vergleich zum Wildtyp. An der Glykosylierungsstelle N201 sind ausschließlich tetraantennäre Strukturen vorhanden. Humanes GM-CSF stimuliert hauptsächlich Granulozyten- und Makrophagenvorläuferzellen und ist an der Regulation der Hämatopoese sowie an Immun- und Entzündungsreaktionen beteiligt. Es wird als Medikament bei Krebspatienten verwendet, um Granulozytopenie, eine Nebenwirkung der Chemotherapie zu vermeiden. GM-CSF ist ein Fusionsprotein, das in HEK293-Zellen exprimiert wurde. Es wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine detaillierte Strukturanalyse der N- und O-Glykane dieses Proteins dargelegt. Bei den N-Glykanen konnten ca. 60 verschiedene Kohlenhydratkompositionen, vor allem Oligosaccharide vom komplexen Typ mit mehrfach Fucose und/oder Sialinsäuren, nachgewiesen werden. In Proben dominierten sialylierte O-Glykane.

Glycosylation is an essential protein post-translational modification that influences biological activity of the protein. Glycosylation is site-specific, depends on the steric hindrance around the glycosylation sites and on the availability of glycosyltransferases. Human alpha-1-antitrypsin (A1AT), produced by hepatocytes, consists of 394 amino acids and is N-glycosylated at Asn-46, Asn-83, and Asn-247. A1AT deficiency is currently treated with A1AT that is purified from human serum. In view of therapeutic applications, rA1AT was produced using a novel human neuronal cell line (AGE1.hn) and the human embryonic kidney 293 (HEK293) cell line. In this study, the N-glycosylation patterns, as well as the site-specificity of the recombinant glycoprotein A1AT and its variants were analyzed by means of mass spectrometry (MS). Glycopeptides were enriched using zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography (ZIC-HILIC) and analyzed using nano-RPLC-MS/MS. Analysis of the site-specificity of A1AT (AGE1.hn) revealed that Asn-247 was mainly occupied by diantennary N-glycans whereas Asn-46 was occupied by bi- and triantennary N-glycans. Asn-83 was exclusively occupied by sialylated tri- and tetraantennary N-glycans. Results show that the production of A1AT in different cell lines (AGE1.hn or HEK293) can have a decisive influence on the carbohydrate side chains of the glycoprotein. Novel A1AT variants having an additional N-glycosylation site at N123 and N201 were recombinantly expressed in HEK293 cells. The site-specific profile of the A1AT variants N123 was mostly composed of monofucosylated bi, tri- and tetraantennary complex-type N-glycans with a tendency toward higher antennary structures compared to the wild-type. Tetraantennary structures were exclusively present at site N201. Human GM-CSF stimulates the majority of the granulocyte- and macrophage progenitor cells and functions as a regulator of hematopoiesis and immune- and inflammatory responses. It is used as a medication for cancer patients to avoid granulocytopenia, which is a possible side effect of chemotherapy. GM- CSF was a fusion protein expressed in HEK293 cells and the structural analysis of its N- and O-glycans is reported in this thesis. A total of 60 N-glycan structures, mostly of the complex-type with fucose and/or sialic acid, were identified. Sialylated O-glycans were found to be the most abundant.