Sphärische, funktionsfähige Hämoglobin-Mikropartikel (Hb-MP) wurden erfolgreich mittels einer neuen einfachen, effizienten und kosteneffektiven drei-Schritt-Methode hergestellt: Copräzipitation von Hb mit CaCO3 zu Hb- CaCO3-MP, Vernetzung des Hb und Auflösung des CaCO3 zu Hb-MP. Die Hb- Einkapselungseffizienzen der MP variierten zwischen 8 und 50 % abhängig von der Ausgangskonzentration der CaCl2 , Na2CO3 und Hb Lösungen. Die Hb-Beladung kann mindestens ein Drittel der Hb-Konzentration in Erythrozyten erreichen. Der MetHb-Gehalt war nach der Herstellung stark erhöht, konnte aber mittels Ascorbinsäure in einen akzeptablen Bereich reduziert werden. Die unmodifizierten Partikel waren durchschnittlich 3,2 µm groß; ein nicht modifizierter Partikel enthielt durchschnittlich 2,2 pg Hb (ca. 2 • 107 Hb- Tetramere). Die Partikel waren aufgrund der GA Vernetzung autofluoreszierend. Die nicht modifizierten Hb MP hatten ein negatives Zetapotential. Nach der Herstellung waren durchschnittlich 7 20 % der Partikel in Abhängigkeit von der bei der Vernetzung eingesetzten GA-Konzentration aggregiert (> 10 µm). Mittels Ultraschall-Behandlung konnten die Aggregate stark reduziert oder beseitigt werden. Die Partikel wurden nach der Inkubation mit Vollblut oder plättchenreichem Plasma in vitro analysiert. Je niedriger die eingesetzte GA- Konzentration bei der Vernetzung war, desto weniger wurden die Partikel phagozytiert, und desto schwächer aggregierten die Partikel in plättchenreichem Plasma. Das Quenchen mit Glycin und die Reduktion mit NaBH4 brachten ebenfalls viele Vorteile. Die Partikel wurden weniger phagozytiert und aggregierten weniger in plättchenreichem Plasma. Die Hb-MP hatten eine starke Sauerstoffaffinität (also einen niedrigen p50). Wird das Hb mit 0,01 % GA unter normalem Luftsauerstoffpartialdruck vernetzt, mit Glycin gequencht und mit NaBH4 reduziert, so haben die Hb-MP einen p50 von weniger als 2 mmHg. Der p50 betrug 7,0 mmHg, wenn die Partikel unter sauerstoffarmen Bedingungen vernetzt wurden. Die PEGylierung der Partikel konnte zwar die Aggregation der MP nach der Herstellung nicht reduzieren, die immunologischen Eigenschaften der Partikel wurden jedoch positiv beeinflusst. Die PEGylierten Partikel aggregierten kaum in plättchenreichem Plasma. Die Partikel hatten ein reduziertes Zetapotential und eine erhöhte Sauerstoffaffinität mit einem p50 von 5,3 mmHg. Hb-Mischpartikel mit HA, HSA oder modifiziert mit Dx wiesen eine reduzierte Aggregation der Partikel nach der Herstellung auf. Im Vergleich zu Hb-MP ohne Modifikation, wurde das Zetapotential der Partikel moderat (bei Hb- HSA-MP) oder stark (bei Hb HA MP oder Hb Dx MP) erhöht. Eine leicht erhöhte Phagozytose der Hb HSA MP und eine stark erhöhte Phagozytose bei Hb-HA-MP oder Hb-Dx-MP waren die Folge. Die modifizierte Copräzipitation mit HSA oder die Modifikation mit Dx konnten die Aggregation der Partikel in plättchenreichem Plasma nicht reduzieren. Es wurde jedoch keine Aggregation nach der Inkubation der Hb-HA-MP mit plättchenreichem Plasma beobachtet. Nach der Einführung von HA, HSA und der Modifikation mit Dx wurde die Sauerstoffaffinität noch einmal erhöht; die p50 von diesen Partikeln waren kleiner als 4 mmHg. Aufgrund der Größe im Mikrometer-Bereich und der hohen Sauerstoffaffinität ist zu vermuten, dass die Partikel nicht in den interstitiellen Raum gelangen und damit ein begrenztes NO-Scavenging haben, und dass sie den Sauerstoff nicht vorzeitig in den präkapillaren Arteriolen freigeben. Somit würden die Partikel keine Vasokonstriktion auslösen. Der niedrige p50 der Hb-MP würde den Einsatz der Partikel bei starker Hypoxie oder in der Tumortherapie erlauben.
Spherical functioning hemoglobin microparticles (Hb-MPs) were successfully produced by a new simple, efficient and cost-effective 3-step method: co- precipitation of Hb with CaCO3 to form Hb-CaCO3 microparticles, cross-linking of Hb and dissolution of CaCO3 template to obtain pure Hb-MPs. The Hb encapsulation efficiencies ranged from 8 to 50 % of the initial amount of Hb depending on the concentration of CaCl2, Na2CO3 or Hb solution used. The Hb- loading of the CaCO3-MPs was at least one third of the Hb content of the RBCs. The methemoglobin content was significantly increased after preparation, but could be reduced to an acceptable range after a post-reduction of the Hb-MPs with ascorbic acid at pH 7.4. The unmodified particles had an average diameter of about 3.2 µm; one unmodified particle contained 2.2 pg Hb (approximately 2 • 107 Hb tetramers). The particles were auto-fluorescent due to the glutaraldehyde (GA) cross-linking. The unmodified Hb-MPs had a negative zeta potential. Depending on the GA concentration used for cross-linking, 7 20 % of the particles were aggregated (> 10 µm). The amount of aggregates could be reduced greatly or eliminated by sonication. The particles were analyzed after incubation with whole blood or platelet rich plasma in vitro. The lower the concentration of GA during cross-linking, the less particles were phagocytized, and the weaker the particles aggregated in the platelet rich plasma. Quenching with glycine and the reduction with NaBH4 also brought benefits. The particles were less phagocytized and less aggregated in platelet rich plasma. The Hb-MPs had a high oxygen affinity (low p50). In the case where 0.01 % GA cross-linked Hb-MPs, which were also quenched with glycine and reduced with sodium borohydride, the p50 was less than 2 mmHg, if the particles were cross-linked under normal atmospheric oxygen partial pressure. The p50 was 7.0 mmHg, if the particles were cross-linked under low-oxygen condition. PEGylation of the particles could not reduce the aggregation after preparation. However, it positively affected the immunological properties of the particles. After sonication, the PEGylated particles hardly aggregated in platelet rich plasma. The particles had a reduced zeta potential and increased oxygen affinity with a p50 of 5.3 mmHg. The preparation of Hb mixture- particles with hyaluronan (HA) or human serum albumin (HSA) or modification with dextran (Dx) reduced the aggregation of the particles after preparation. Compared to unmodified Hb-MPs, the zeta potential of particles was moderately (by Hb-HSA-MPs) or strongly (by Hb-HA-MPs and Hb-Dx-MPs) increased. A slightly increased phagocytosis of particles which were co-precipitated with HSA and significantly increased phagocytosis of particles which were co-precipitated with HA or modified with Dx were observed. The preparation of mixture- particles of Hb and HSA or modification with Dx could not reduce the aggregation of the particles in platelet rich plasma. After incubation of the Hb-HA-MPs with platelet rich plasma, no aggregation was observed. After modification with HA, HSA or Dx, the oxygen affinity was increased again; the p50s from these particles were smaller than 4 mmHg. Due to their size in the micron range and their high oxygen affinity, it is to expect that our particles would not access to vascular space and thus would have a limited scavenging of the vasodilating agent nitric oxide (NO), and they would not release O2 prematurely in the precapillary arterioles. Therefore, the particles would not cause vasoconstriction. The low p50 of the Hb-MPs would allow their use as targeted oxygen delivery system to hypoxic tissues which are observed in case of severe hypoxia and tumors.