dc.contributor.author
Duque Zapata, Luisa
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:04:38Z
dc.date.available
2017-04-12T10:35:14.830Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2013
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6215
dc.description.abstract
Different drug delivery systems have been developed for peptides and proteins,
with special interest on those that allow sustained parenteral release; they
can prolong protein circulation, resulting in better therapeutic results and
higher patient compliance. However, many of the manufacturing methods used
involve conditions that can be detrimental for these molecules, such as the
use of organic solvents, pH gradients, reduced pressure or heat. Besides,
obtaining the desired formulation performance might be difficult since the
dissolution profile might be far from optimal, or because the integrity of
these bio-macromolecules cannot be preserved within the matrix. Thus, the
development of these systems has followed a complex and challenging route,
which have resulted in long development periods and few commercialized
products. Therefore, gathering additional understanding of these systems and
defining key parameters that impact the performance of them, is important to
accelerate and assist the development of parenteral sustained release systems.
This work focused on the development of biodegradable implants for protein
delivery, using ovalbumin (OVA) as acid-labile model protein. Hot melt
extrusion (HME) was selected as the manufacturing method, since it does not
involve the use of solvents and the protein can be incorporated on its more
stable dry state, avoiding the creation of interfaces that compromise protein
stability. Nonetheless, the use of high temperatures and presence of shear
forces might impact protein stability. Therefore, the feasibility of HME to
prepare OVA-loaded implants was investigated. With this purpose, a mini-ram
extruder (syringe-die device) was used as a rapid screening tool. Moreover,
two types of biodegradable matrices (PLGA- and lipid-based) were used to
assess differences on formulation performances, with special emphasis on
dissolution and protein stability. OVA was stable during extrusion as
indicated by SEC-HPLC, FTIR, CD and fluorescence spectroscopy. It showed
comparable behaviors when analyzed as received and after extraction from the
freshly prepared implants. This was observed for the two types of matrices
used, indicating that they might have a protective effect on the protein. As
they melt or soften during the process, they may act as a “protective cushion”
against heat and shear forces. In the case of PLGA-based implants, OVA release
was characterized by a low burst and a slow release up to day 21 which
plateaued thereafter, resulting in incomplete release for all evaluated
protein loadings. The percolation threshold of this matrix was reached at
loadings ≥25%, but cumulative releases did not reach 100% either. Release
incompleteness was accompanied by the formation of an insoluble residual mass.
Characterization of this mass indicated that it consisted of non-covalent
protein aggregates and polymer, where ovalbumin was ionically bound as the pH
inside the degrading matrix felt below the pI of the protein. Exposure to the
acidic microclimate created by the degradation process of the matrix induced
structural changes in OVA by increasing its hydrophobicity and its -sheet
content. Furthermore, the autocatalytic rate of hydrolysis of PLGA was
decreased in the presence of OVA since the later has certain buffering
capacity. These changes increased the likeliness of protein-protein ad
protein-polymer/oligomer interactions. To create a viscous environment within
the implant, PVP and Poloxamer were used as protein co-excipients. For this,
these compounds were dissolved together with the protein and freeze-dried
prior blending with the polymer and extrusion. The release of OVA during the
first days was increased, indicating that these excipients effectively
decreased the adsorption of the protein on the PLGA. Nonetheless, they were
not able to control the acidic inner pH and thus, OVA aggregation was not
prevented and release incompleteness was still observed. Furthermore, there
were changes in OVA secondary structure caused by the freeze-drying process
and the interaction of the co-excipients and the protein when they were in
solution. The optimization of the freeze-drying conditions and co-
excipient:protein ratio could improve the stability of the protein. However,
strategies to control the acidic microclimate may still be required in order
to obtain an optimal formulation. PEG of various molecular weights were used
as “pore formers” (10% loading). At lower PEG’s molecular weight, higher OVA
cumulative release was obtained. This was attributed to the differences on PEG
hydrophilicity, which is higher at lower molecular weights. However, the
release plateaued after 21 days in all the cases, most probably caused by pore
closure of the matrix after PEG had diffused out rapidly during the first
weeks, as well as by the uncontrolled acidic microclimate. Sugars and
inorganic salts were also evaluated as pore forming agents (at 10% loading).
Unfortunately, incomplete release was still observed; they were not able to
control the acidic pH and induced OVA aggregation by increasing the ionic
strength within the matrix. Hence, they were unsuitable to improve the release
completeness of OVA from PLGA-based implants Since the acidic microclimate was
found to be the primary trigger for the incomplete release of OVA, pH
modifiers were incorporated within the matrix. The use of MgCO3 and Mg(OH)2
(3.5% loading) increased the released fraction of OVA in a 20% and 10%
respectively. They also delayed by one week the degradation onset of PLGA
thanks to their neutralization effect during the first weeks of dissolution.
Nevertheless, release incompleteness was still observed since this effect did
not last long and the pH was not kept above OVA’s pI. Higher amounts of these
co-excipients should be used to achieve a long-lasting effect. However, this
increase may result in an increase in the inner ionic strength and the
induction of OVA aggregation, which is unfavorable. Changing the polymer
matrix to a slower-degrading one, where the pH drops slower, could work as
well, but care should be taken to avoid greater increase in hydrophobicity
that might hinder the protein. With the use of shellac, a well-known enteric
and biocompatible polymer, as protective co-excipient (1:5 and 1:10
protein:shellac ratio), a distinct late release phase occurred and release
completeness was increased to more than 75% (cumulative release). Shellac
seemed to protect the protein against the acidic microclimate due to its low
solubility at low pH. The so protected OVA was then released once the pH
increased, due to the declining PLGA-oligomer formation. The result was a
triphasic release profile, consisting of an initial burst, a slow diffusion
phase over about 7 weeks, and an erosion-controlled dissolution phase over the
next three weeks. An acid-labile protein like OVA was thus effectively
protected from an interaction with PLGA and its degradation products,
resulting in a controlled delivery of more than 90% of the original payload.
One of these formulations (1:5 OVA:shellac ratio) was up-scaled from the mini-
ram extruder to a twin-screw extruder using a scale-up size factor of 15. No
substantial differences on OVA integrity between both extrusion methods were
detected. The dissolution for the up-scaled formulation showed also a
triphasic release profile, but with a lower burst release (10% vs. 30%),
probably caused by a densification of the matrix after extrusion. The
dissolution of the protein during the erosion-controlled phase of release was
slightly slower for the up-scaled formulation and lasted longer (8 vs. 3
weeks) reaching also more than 75% of cumulative release. These differences
were attributed to the lower burst release and less pore formation, which
slowed down the protein’s diffusion. In both cases an insoluble mass remained
after the release. However, it was identified as undissolved shellac together
with the small portion of unreleased protein. A further characterization of
the degradation properties of these implants will be interesting to assess
their suitability as a depo formulation intended for multiple applications.
Storage stability of the up-scaled formulation indicated a change in thermal
properties (decrease in Tg) and dissolution profile over the time when the
implants were stored at 25°C, being more drastic for storage temperatures
above the formulation’s Tg (37°C) since mobility of the polymer chains and re-
arrangements into a less rigid structure occurred. No substantial changes in
OVA’s hydrophobicity or formation of additional aggregates were observed when
the implants were stored at 25°C. Protein conformational changes and increase
of interactions between the matrix and the protein were induced by higher
storage temperatures. The dissolution profile was comparable for all the
evaluated implants prior and after storage during the burst release and lag
phase. Differences were observed during the erosion phase, which could be
attributed to the decrease on Tg after storage, with a faster release upon
storage for longer time. In conclusion, the implants should be stored at
refrigerated conditions to guarantee their proper performance and avoid
undesirable changes. Compared with the case of PLGA, OVA was generally more
stable both within the lipid-based matrix and during its release from it,
since no acidic environment was created (pH was always 6.8). The extrusion
process did not alter the polymorphism of D114 or D118, but it induced a
reordering of the lipidic chains in the case of DP60. However, this reordering
was always observed, indicating that this lipid adopted a more stable
conformation after extrusion. The release of OVA from the lipid-based implants
was mainly driven by diffusional processes: influx of water that dissolved the
protein allowing its efflux. It was also dependent on the crystallinity degree
of the lipidic matrix used: the release was slower and longer when a more
amorphous and heterogeneous lipid, like DP60, was used. In contrast, the
presence of crystallites within the structure of more crystalline materials,
like D114 and D118, led to a higher anisotropy of the protein distribution
yielding to a faster release. Incomplete release from the DP60 matrix was
observed when OVA was loaded at 5%, but without the formation of insoluble
aggregates. This behavior was attributed to possible stronger physical
interactions between the protein and the matrix. By increasing the protein
loading, faster and more complete release was observed, which can be ascribed
to the formation of more and/or bigger pores at higher protein loadings.
Loading lysozyme, a smaller protein, instead of OVA resulted in a more
prolonged release with similar time-frame for D118 and DP60. This was probably
caused by the creation of smaller and less interconnected pores, and a
stronger physical interaction between the matrix and the protein. A deeper
investigation on these interactions and the distribution of the protein within
the matrix might be helpful to determine their possible impact on
microstructural rearrangement upon storage. The use of PLA as a co-excipient
on the D118-lipid matrix was a suitable approach to prolong the release of OVA
from 1 week to 1 month without the detrimental effects that the polymeric
matrix could have on the protein. In contrast, incorporation of PEG in the
DP60-based matrix accelerated the diffusion rate of the protein during the
first weeks of release. This effect was correlated with PEG’s molecular
weight: the lower it was, the faster the release obtained. The release from
DP60-based implants was also faster when binary lipid blends were used. The
rate was related to the fatty acid chain length of the secondary lipid: by
being shorter the release was faster. This could be ascribed to the decrease
in lipid wettability with the increase on its chain length, since diffusivity
of the protein depends on the influx of water. Thermal characterization of
these blends indicated that the lipids did not mixed at a molecular level,
presenting some phase separation. In this case, it would be recommended to use
an extruder that compounds the materials while they are in their molten state.
This could avoid changes on the lipidic microstructure after storage. In
general, the dissolution of OVA was successfully tuned by the inclusion of
more hydrophobic or more hydrophilic excipients, leading to different
dissolution speeds with times ranging from 2 to 15 weeks. The versatility of
these systems without the inclusion of many components makes them an
attractive option for protein delivery with various applications.
Crystallinity changes in the lipid matrices were observed after curing under
different conditions; these changes also had a significant effect on the
dissolution profile of OVA. All the cured DP60-based implants as well as the
D118-ones cured at 50°C presented a faster dissolution, ascribed to the
creation of larger channels that increased the diffusivity of OVA. In
contrast, slower diffusion was observed for the D118-based implants cured at
40°C. In this case the partial melting of the lipid might have created a
denser matrix. In general, the DP60 matrix showed less polymorphic changes,
probably due to its more heterogeneous and amorphous character. This could
represent a more stable formulation without unpredictable variations upon
storage. A sustained and prolonged OVA release formulation with optimized
dissolution was obtained after the application of a Design of Experiments
(DoE). The used Taguchi method allowed to study four factors at three
different levels, with a reduction of experimental runs from 81 to 27, thanks
to the use of an orthogonal array. It was found that the release of OVA was
significantly influenced by the matrix composition and protein loading, and to
a lesser extent by the curing conditions (temperature and time). Based on the
results, a formulation with 5% protein loading, DP60/D118 (50:50) as matrix
and curing at 40°C during 60 minutes was found to be the optimal one with a
constant release over 28 weeks at a rate of ~2.8%/week. DoE is a valuable tool
that allows the evaluation of various formulation and process parameters
without incurring on unnecessary experiments. Gamma-irradiation affected the
performance of both prepared formulations, PLGA:shellac- and lipid-based, and
it proved to be unsuitable for the OVA-loaded implants. Increase in protein
hydrophobicity, changes in OVA dissolution and induction of rearrangements
within the biodegradable matrix were caused by the sterilization process. The
use of a cooling agent during the irradiation decreased the magnitude of these
changes, because molecule mobility was reduced, but it did not avoid them.
Further evaluation of the polymers’ molecular weight distribution, protein and
matrix distribution and free radical formation would be ideal to fully
understand the effect of irradiation on the implants and to assess whether the
incorporation of other co-excipients (e.g. antioxidants) could maintain the
physicochemical characteristics of the formulation after irradiation. A
suitable alternative may be the use of a low-bioburden sterilization process,
which could produce sterile implants that maintain their physicochemical
properties after irradiation at a lower dose. In conclusion, HME was a
suitable process for the preparation of biodegradable implants with sustained
and prolonged release of OVA. Different types of matrices were evaluated,
obtaining different release patterns and various releasing times. Protein
stability and release completeness were improved after understanding its
degradation mechanism and the corresponding key formulation parameters. The
ability to obtain tailored properties out of the same dosage form, makes
biodegradable implants an interesting and promising candidate for protein
delivery.
de
dc.description.abstract
Verschiedene Systeme für die kontrollierte Freisetzung von Peptid- und
Proteinwirkstoffen aus Arzneimittelpräparaten sind entwickelt worden. Der
Fokus wurde auf diejenigen gesetzt, die eine anhaltende parenterale
Freisetzung ermöglichen, sie können die Proteinfreisetzung verlängern. Dies
führt zu einer Verbesserung der therapeutischen Ergebnisse, sowie der
Compliance der Patienten. Viele von den aktuellen Herstellungsmethoden werden
unter Bedingungen durchgeführt, die schädlich für solche Moleküle sein können,
z. B. die Anwendung von organischen Lösemitteln, pH-Gradienten, Vakuum
und/oder Hitze. Auch die Herstellung der Formulierung mit den gewünschten
Freisetzungsparametern kann schwierig sein, weil das gewünschte
Freisetzungsprofil nicht optimal ist, oder weil die Integrität dieser
Biomakromoleküle in der Matrix nicht haltbar ist. Die Entwicklung dieser
Systeme ist eine komplexe und herausfordernde Aufgabe mit langen
Entwicklungszeiten und wenigen kommerzialisierten Produkten als Schlussfolge.
Sowohl das Sammeln von neuen Erkenntnissen über diese Systeme, als auch die
Feststellung der wichtigsten Parametern, die das Verhalten der Präparate
beeinflussen, ist daher von Bedeutung um die Entwicklung von Präparaten zur
Parenteral-Wirkstofffreisetzung zu unterstützen und zu beschleunigen. Diese
Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung von bioabbaubaren Implantaten zur
Proteinwirkstofffreisetzung. Es wurde Ovalbumin (OVA) als Säure-labiles
Modellprotein verwendet. Die Herstellungsmethode der Wahl war Schmelzextrusion
(Hot melt extrusion, HME), da organische Lösemittel dabei nicht benötigt
werden und das Protein in seinem stabilsten, trockenen Zustand hinzugefügt
werden kann. Dabei wird auch die Erzeugung von weiteren Grenzflächen
vermieden, die die Proteinstabilität gefährden können. Nichtsdestotrotz, die
Verwendung von hohen Temperaturen und die dazugehörigen Scherkräfte können
eine negative Wirkung auf die Proteinstruktur haben. Daher wurde untersucht,
ob OVA enthaltende Implantate mit Hilfe der HME hergestellt werden können. Um
dies zu untersuchen wurde ein Mini-Ram Extruder (Syringe-die-Gerät) als
Screening-Werkzeug genutzt. Zum Vergleich wurden zwei verschiedene
bioabbaubaren Matrix-Bildner (PLGA- und Lipide-basierte) ausgewählt, um die
Freisetzung und Proteinstabilität zu untersuchen. Laut SEC-HPLC-, FTIR-, CD-,
und Fluoreszenzspektroskopie war das OVA während der Extrusion stabil.
Vergleichbare Ergebnissen wurden beim neu vom Lieferant erhaltenen OVA und dem
OVA ermittelt, das aus den hergestellten Implantaten extrahiert wurde. Dieses
Ergebnis ist bei beiden Matrizen beobachtet worden, was ein Hinweis auf den
Schutzeffekt auf das Protein sein kann. Wenn sie während das Prozess schmelzen
oder weich werden, können sie als „Schutzkissen“ gegen Hitze oder Schubkräfte
fungieren. Bei PLGA-basierten Implantaten zeigte die OVA-Freisetzung eine
anfängliche kurze schnelle Freisetzung (burst release) auf die eine langsame
Freisetzung folgte, die nach 21 Tagen in einem Plateau endete. Keine der
untersuchten Formulierungen zeigte eine 100%ige Freisetzung. Die
Perkolationsschwelle dieser Matrizen wurde bei Ladungen von 25% erreicht,
selbst die kumulative Freisetzung erzielte keine 100%. Die unvollständige
Freisetzung ging mit der Absetzung von einem unlöslichen Niederschlag einher.
Die Charakterisierung von diesem Feststoff zeigte, dass es aus nicht-
kovalenten Proteinaggregaten und Polymer bestand, in dem Ovalbumin ionisch
gebunden wurde, als der pH in der abbaubauenden Matrix unter den
isoelektrischen Punkt des Proteins fiel. Der Kontakt zu dem sauren Mikroklima,
das der Abbauprozess der Matrix erzeugt hat, kann strukturelle Änderungen in
der OVA-Struktur verursachen, z.B. die Erhöhung der hydrophoben Eigenschaften
und der -Faltblatt-Anteile. Außerdem ist die autokatalysierte
Hydrolysegeschwindigkeit des PLGAs bei der Anwesenheit von OVA gesunken, da
das Protein gewisse Puffer-Eigenschaften besitzt. Diese Änderungen erhöhen die
Wahrscheinlichkeit von Protein-Protein und Protein-Polymer/Oligomer
Wechselwirkungen. Um eine viskose Umgebung innerhalb die Implantate zu
generieren, wurden PVP und Poloxamer als Hilfsstoff angewendet. Diese
Zusatzstoffe wurden zusammen mit dem Protein in Lösung gebracht und dann
gefriergetrocknet, bevor sie dann mit dem Polymer gemischt wurden um die
Extrusion durchzuführen. Die Freisetzung von OVA war während der ersten Tage
erhöht. Dies weist darauf hin, dass diese Träger gewissermaßen die Adsorption
des Proteins auf dem PLGA herabsetzen. Trotzdem waren sie nicht in der Lage,
das Ansäuern des inneren pHs zu kontrollieren um die Aggregation von OVA zu
vermeiden, sodass auch in diesem Fall keine vollständige Freisetzung
beobachtet wurde. Außerdem gab es Änderungen in der Sekundärstruktur des OVAs,
die sowohl von dem Gefriertrocknungsprozess als auch von der Wechselwirkung
mit dem gelösten Träger verursacht worden sind. Die Optimierung der
Prozessparameter bei der Gefriertrocknung und des Protein/Träger-Verhältnisses
können die Proteinstabilität verbessern. Strategien um das saure Mikroklima zu
kontrollieren sind allerdings immer noch notwendig, damit eine optimale
Formulierung hergestellt werden kann. PEG mit verschiedenen Molmassen wurde
als „Poren-Bilder“ (10%-Ladung) genutzt. Je kleiner die Molmasse des PEGs war,
desto höher war die erhaltene Kumulative-Freisetzung des OVAs. Dies ist eine
Konsequenz der unterschiedlichen hydrophoben Eigenschaften des PEGs, die
größer werden, wenn das Molgewichte steigt. Nichtsdestotrotz hat die
Freisetzung nach 21 Tagen in jedem Fall ihr Maximum erreicht. Die Gründe dafür
liegen höchstwahrscheinlich an dem Poren-Verschluss der Grundmasse, nach dem
PEG während der ersten Wochen rausdiffundierte, sowie an dem unkontrollierten
sauren Mikroklima. Zucker und anorganische Salze wurden auch als „Poren-
Bilder“ getestet (10%-Ladung). Leider ist die unvollständige Freisetzung immer
noch beobachtet worden. Diese Zusätze waren nicht in der Lage den sauren pH zu
puffern und haben die OVA-Aggregation aufgrund der erhöhten Ionenstärke in der
Matrix gefördert. Von daher waren sie nicht geeignet, die
Freisetzungsvollständigkeit von OVA aus PLGA-basierte Implantaten zu
verbessern. Es wurde festgestellt, dass das saure Mikroklima der Hauptgrund
zur unvollständigen Freisetzung von OVA war. Deswegen wurden pH-modifizierende
Reagenzien zu dem System hinzugefügt. Die Verwendung von MgCO3 und Mg(OH)2
(3,5%-Ladung) hat die Freisetzung von OVA jeweils um 20% und um 10% erhöht.
Diese Zusätze haben durch den neutralisierenden Effekt innerhalb der ersten
Wochen den Beginn der Zersetzung des PLGAs hinaus gezögert. Dabei ist die
unvollständige Freisetzung wieder beobachtet worden, da dieser Effekt nicht
lange genug aufrechterhalten und der pH nicht über dem isoelektrischen Punkt
des OVAs gehalten wurde. Höhere Mengen dieser Additive müssen hinzugefügt
werden um einen dauerhaften Effekt zu bewirken. Andererseits könnte diese
Erhöhung eine Steigung der Ionenstärke verursachen und damit die Aggregation
des OVA, was ungünstig wäre. Die Veränderung der Polymermatrix zu einem
langsamer abbauenden PLGA, bei dem der pH langsamer absinkt, könnte auch zu
einer Verbesserung führen, jedoch muss eine zu große Erhöhung der hydrophoben
Eigenschaften vermieden werden, da es das Protein negativ beeinflussen kann.
Durch die Verwendung von Schellack, einem bekannten magensaftresistenten und
biokompatiblen Polymer als Schutz-Hilfsstoff (1:5 und 1:10 Protein:Schellack
Verhältnis), fand eine verspätete Freisetzung mit einer kumulativen
Freisetzung von 75% statt. Schellack scheint das Protein gegen das saure
Mikroklima dank seiner niedrigen Löslichkeit bei niedrigen pH-Werten zu
schützen. Das so geschützte OVA wird dann freigesetzt, wenn der pH durch die
abnehmende PLGA-Oligomer Bildung wieder erhöht wird. Das Ergebnis war ein
drei-Phasen Freisetzungsprofil, bestehend aus einer anfänglichen schnellen
Freisetzung, einer langsamen Diffusion-kontrollierten Phase, die länger als 7
Wochen war und einer Erosions-kontrollierten Freisetzungsphase in den
folgenden drei Wochen. Ein Säure-labiles Protein wie OVA kann somit
erfolgreich gegen die Wechselwirkungen mit PLGA und seinen Abbauprodukten
geschützt werden, damit eine kontrollierte Freisetzung von mehr als 90% der
ursprünglichen Ladung erreicht wird. Eine von diesen Formulierungen wurde mit
einem Doppelschneckenextruder in einem 15-fach größeren Maßstab hergestellt.
Zwischen beiden Methoden sind keine erkennbaren Unterschiede in der OVA-
Integrität beobachtet worden. Die Freisetzungsuntersuchungen für die im
Produktionsmaßstab erzeugten Extrudate haben das gleiche drei-Phasen Profil
ergeben, allerdings mit einer kleineren Anfangsfreisetzung (10% statt 30%),
wahrscheinlich wegen einer Verdichtung der Matrix nach der Extrusion. Die
Proteinfreisetzung während der Abbau-kontrollierten Phase ist bei den
Implantaten, die im vergrößerten Produktionsmaßstab hergestellt wurden, etwas
langsamer und dauerte länger (8 statt 3 Wochen). Die kumulative Freisetzung
betrug zudem mehr als 75%. Diese Unterschiede können durch die kleinere
anfängliche Freisetzung und die geringere Poren-Erzeugung erklärt werden,
wodurch die Protein-Diffusion langsamer wird. In beiden Fälle ist eine
unlösliche Masse nach dem Versuchen zurückgeblieben. Sie bestand aus
ungelöstem Schellack und einer kleinen Menge nicht-freigesetzten Proteins.
Eine weiterführende Charakterisierung solcher Implantate könnte interessant
sein, um seine Eignung zur Herstellung von Depotformulierungen mit mehrfacher
Freisetzung zu prüfen. Versuche bezüglich der Lagerungsstabilität bei der
vergrößerten Formulierung haben Änderungen gezeigt, sowohl in den thermischen
Eigenschaften (Minderung des Tgs), als auch in dem Freisetzungsprofil, wenn
die Implantate bei 25°C gelagert wurden. Bei Lagerungstemperaturen über der
Formulierungs-Tg (37°C) waren eindeutiger, da die Mobilität von den
Polymerketten gefördert wurde. Wenn die Implantate bei 25°C gelagert worden
sind, konnten weder entscheidende Änderungen in den hydrophoben Eigenschaften
des OVAs, noch die Entstehung von weiteren Aggregaten festgestellt werden. Bei
höheren Lagertemperaturen sind sowohl konformative Veränderungen beim OVA als
auch stärkere Protein-Matrix Wechselwirkungen zu erwarten. Die
Freisetzungsprofile der untersuchten Implantate waren vor und nach der
Lagerung, sowohl für die anfängliche Freisetzungsphase, als auch während die
Verzögerungsphase, vergleichbar. In der Erosions-Phase wurden Unterschiede
gesehen, die durch die Minderung des Tgs nach der Lagerung erklärt werden
können und dadurch eine schnelleren Freisetzung nach langen Lagerungszeiten
verursachten. Die Implantate müssen daher gekühlt gelagert werden, um eine
optimale Funktion zu garantieren und um ungewünschte Änderungen zu vermeiden.
Im Vergleich zu den Formulierungen mit PLGA ist OVA in einer Lipid-Matrix
generell stabiler, sowohl in der Lagerungsform als auch beim Rausdiffundieren,
da keine saure Umgebung entsteht (pH-Werte sind immer 6.8). Das
Extrusionverfahren hatte keinen Einfluss auf den Polymorphismus von D114 oder
D118, obwohl es gewisse strukturelle Änderungen in DP60 verursacht hat. Diese
Änderungen sind immer wieder beobachtet worden; sie weisen darauf hin, dass
diese Lipide eine stabilere Konformation nach der Extrusion erreichen. Die
Freisetzung von OVA aus lipidischen Implantaten ist hauptsächlich von
Diffusionsprozessen kontrolliert, das Wasser diffundiert rein und das gelöste
Protein diffundiert raus. Es war auch von der Kristallinität der verwendeten
lipid-Matrix abhängig. Die Freisetzung war langsamer und länger, wenn ein
amorpheres und heterogeneres Lipid (wie DP60) verwendet wurde. Dem gegenüber
führte die Anwesenheit von Kristalliten innerhalb der Matrix durch
kristallines D114 oder D118 zu einer höheren Anisotropie in der
Proteinverteilung und damit zu einer schnelleren Freisetzung. Eine
unvollständige Freisetzung aus einer PD60-Matrix mit einer OVA-Ladung von 5%
wurde beobachtet, allerdings ohne die Bildung eines unlöslichen Aggregates.
Dieses Verhalten könnte durch die stärkeren Wechselwirkungen zwischen OVA und
der Matrix erklärt werden. Die Freisetzung bei höheren Proteinbeladungen war
schneller und ausgeprägter, wahrscheinlich durch die Bildung von mehreren und
größeren Poren. Die Beladung von Lysozyme, einem kleineren Protein als OVA
zeigte in einem vergleichbaren Zeitfenstern längere Freisetzungszeiten mit
D118 und DP60. Grund dafür könnte die Bildung von wenigen, kleineren, schlecht
verbundenen Poren und eine stärkere Wechselwirkung mit der Matrix sein. Eine
weiterführende Untersuchung dieser Wechselwirkungen zusammen mit der
Proteinverteilung in der Matrix könnte hilfreich sein, um die möglichen
Einflüsse von mikrostrukturellen Umlagerungen nach der Lagerung zu verstehen.
Die Verwendung von PLA als Träger in der D118-lipid-Matrix war eine
zielführende Lösung, um die OVA-Freisetzung von 1 Woche bis zu 1 Monat zu
verlängern, ohne die schädlichen Wirkungen der Matrix auf das Protein zu
erhalten. Der Zusatz von PEG in die DP60-Matrix hat die
Diffusionsgeschwindigkeit von OVA während der ersten Wochen der Freisetzung
beschleunigt. Dieser Effekt war von der Molmasse des PEGs abhängig, je kleiner
sie war, desto schneller fand die Freisetzung statt. Die Freisetzung aus
DP60-basierten Implantaten war schneller, wenn binäre lipidische Mischungen
verwendet worden sind. Die Geschwindigkeit war von der Kettenlänge der
Fettsäuren der zweiten Lipide abhängig, je kürzer die Ketten, desto schneller
die Freisetzung. Es könnte die Folge einer Erhöhung der hydrophoben
Eigenschaften der Lipide mit deren Kettenlänge sein, da die Proteindiffusion
vom Eindringen des Wassers abhängig ist. Die thermische Charakterisierung
solcher Mischungen hat gezeigt, dass sich die Lipide auf der molekularen Ebene
nicht miteinander mischen und eine Phasentrennung stattgefunden hat. In diesem
Fall kann es empfehlenswert sein einen Extruder zu nutzen, der beide
Materialien in geschmolzenem Zustand aufarbeiten kann. Das könnte die
Änderungen der lipidischen Mikrostruktur während der Lagerung vermeiden. Die
Freisetzung von OVA könnte durch die Zugabe von hydrophoben oder hydrophilen
Trägern erfolgreich eingestellt werden. Dies führt zu einstellbaren
Freisetzungsgeschwindigkeiten mit Zeiten von 2 bis 15 Wochen. Die
Vielseitigkeit dieser Systeme, ohne Zugabe von mehreren Komponenten, macht
dieses Verfahren vielversprechend für verschiedene
Proteinfreisetzungsanwendungen. Nach Wärme-Aufarbeitung unter verschiedenen
Bedingungen wurden Veränderungen in der Kristallinität der Lipide-Matrizen
beobachtet. Solche Änderungen hatten auch einen wichtigen Einfluss auf die
OVA-Freisetzungsprofile. Alle Wärme-aufgearbeiteten (bei 50°C) Implantate,
sowohl die DP60-, als auch die D118-basierten, haben schnellere Freisetzungen
gezeigt, wahrscheinlich wegen der Bildung von längeren Kanälen, die die
Diffusität von OVA fördern. Im Gegensatz dazu, eine langsamere Diffusion wurde
bei den D118-Implantaten beobachtet, die bei 40°C Wärme-aufgearbeitet worden
sind. Grund dafür könnte das partielle Schmelzen sein, das eine Verdichtung
der Matrix hervorruft. Im Allgemeinen, die DP60-Matrix zeigte weniger
polymorphische Änderungen, vielleicht wegen seinen heterogenen und amorphen
Eigenschaften. Das könnte zu einer stabileren Formulierung führen, ohne
unvorhersehbare Änderungen währen der Lagerung. Ein optimiertes und
verlängertes OVA-Freisetzungsprofil wurde durch die Anwendung von „Design of
Experiments“ (DoE) erhalten. Mit Hilfe der Taguchi Methode, konnten vier
Faktoren auf drei Ebenen untersucht werden. Dies mit einer Verminderung von 81
auf 27 Versuche, Dank der Verwendung eines orthogonalen Arrays. Es wurde
gefunden, dass die Freisetzung vom OVA von der Matrix-Zusammensetzung und der
Proteinbeladung stark beeinflusst war, aber weniger von den Wärme-Bedingungen
bezüglich Temperatur und Zeit. Auf diesen Ergebnissen basierend wurde eine
Formulierung mit 5%-Proteinbeladung, aus DP60/D118 (50:50) und Wärme-
Aufarbeitung von 60 Minuten bei 40°C als optimal bezeichnet, mit einer
dauerhaften Freisetzung von 28 Wochen und eine Geschwindigkeit von 2,8% pro
Woche. DoE ist ein außerordentlich wertvolles Instrument, das die Evaluierung
von Bedingungen und Prozessparametern ermöglicht, ohne unnötige Experimente
mache zu müssen. Gamma-Strahlung hatte einen negativen Einfluss auf die
Eigenschaften von beiden Formulierungen, PLGA/Schellack und Lipide-basierte,
und schien für OVA-beladene Implantate ungeeignet zu sein. Erhöhung der
hydrophoben Proteineigenschaften, Änderungen in OVA-Löslichkeit und
Umlagerungen in der Polymer-Matrix sind bei dem Sterilisationsprozess erzeugt
worden. Die Verwendung eines Kühlungsmittels während des Strahlens konnte die
Intensität dieser Effekte mindern, weil die Bewegung der Moleküle reduziert
wurde, obwohl es nicht vollkommen vermieden werden konnte. Weitere
Untersuchungen über die Mol-Gewicht-Verteilung der Polymere, Proteinverteilung
in der Matrix und Bildung von freien Radikalen wären nötig, um den Einfluss
der Strahlung auf die Implantate zu verstehen. Damit kann man Strategien
entwickeln – zum Beispiel, die Zugabe von Additiven mit
Antioxidierungseigenschaften – um die physikochemischen Eigenschaften der
Formulierung nach der Bestrahlung zu erhalten. Eine mögliche Lösung wäre die
Anwendung von „low-bioburden“ Sterilisationsprozessen, die sterile Implantate
mit haltbaren physikochemischen Eigenschaften produzieren könnten, nach
Bestrahlung bei kleineren Dosen. Zum Schluss, HME war ein geeignetes Verfahren
zur Herstellung von bioabbaubaren Implantaten mit ausdauernder und dauerhafter
Freisetzung von OVA. Verschiedene Sorten von Matrizen wurden untersucht und
die verschiedenen Freisetzungsparameter bei verschiedenen Zeiten wurden
gemessen. Sowohl Proteinstabilität, als auch die Freisetzungsvollständigkeit
wurden verbessert, nachdem die Zersetzungsmechanismen und die entsprechenden
Bedingungen verstanden wurden. Die Möglichkeit maßgeschneiderte Eigenschaften
aus der gleichen Darreichungsfrom zu erzielen, macht bioabbaubare Implantate
interessante und vielversprechende Kandidaten für die
Proteinwirkstofffreisetzung.
de
dc.format.extent
146 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Biodegradable implants
dc.subject
Hot melt extrusion
dc.subject
Protein stability
dc.subject
Protein release
dc.subject
poly(lactide-co-glycolide)
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Development of biodegradable implants for extended delivery of proteins
dc.contributor.contact
luisa.duque@fu-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Roland Bodmeier
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Philippe Maincent
dc.date.accepted
2017-03-28
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000104513-7
dc.title.translated
Entwicklung von bioabbaubaren Implantaten zur ausdauernd
Proteinwirkstofffreisetzung
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000104513
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000021332
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access