Entwicklung eines Mikropartikelhydrolysesondenassays für die Genexpressionsanalyse

Abstract

Die Entwicklung effektiver Behandlungsmethoden bei kardialen Erkrankungen basiert auf einem umfangreichen Verständnis zellphysiologischer und genregulatorischer Abläufe in Herzmuskelzellen. Kenntnisse über die Genexpression und Charakteristika der involvierten Moleküle ermöglichen Rückschlüsse auf die Reaktion nach Stressereignissen. Es existieren vielzählige Technologien mit denen Genanalysen und Charakterisierung von Biomolekülen möglich sind. Jedoch sind diese i) meist im Multiplexgrad begrenzt, ii) auf eine bestimmte Aufgabe beschränkt, iii) können keine temperaturgesteuerten Real-Time-Anwendungen abarbeiten, iv) haben hohe technische Anforderungen und/oder v) verursachen hohe Kosten. Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer neuen technologischen Plattform, bezeichnet als VideoScan, zusammen mit Assays zur Amplifikation und Quantifizierung von Nukleinsäuren humanen Ursprungs. Um den Ansprüchen der modernen Multiparameternukleinsäureanalytik gerecht zu werden, wurden homogene Assays für quantitative Messungen von Biomolekülen entworfen. Ein Vorsprung über existierende Bioanalytiktechnoligien sollte durch Kombination der mikropartikelbasierten VideoScan-Technologie mit Standardlabormethoden erreicht werden. Zunächst wurden Methoden zur Charakterisierung der Materialien, Sondensysteme und neue Assayformate etabliert. Die neuartige mikropartikelbasierte Technologie wurde für die Multiparameteranalytik charakterisiert und Reaktionsabläufe für die Genexpressionsanalyse entwickelt. Das VideoScan-System wurde um Verfahren zur Kinetikmessung von Hybridisierungsassays, Schmelzkurvenanalysen, und Quantitative-Real-Time-PCRs im Multiplexformat erweitert. Für die Analyse der Kinetikmessdaten wurden Algorithmen und Plugins in eine Statistiksoftware implementiert. Mikropartikelbasierte Assays benötigen eine homogene Funktionalisierung der Mikropartikeloberfläche um in Assays optimal genutzt werden zu können. Dafür wurde ein Fluoreszenzfarbstoffadsorptionsassay entwickelt, mit dem die Qualität und Quantität der Mikropartikelcarboxylierung routinemäßig kontrolliert werden kann. Darauf aufbauend wurden Strategien für die optimale kovalente und nicht-kovalente Immobilisierung von Biomolekülen evaluiert. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig ein Gesamtsystem bestehend aus vollständig charakterisierten Mikropartikeln, Auswertungssoftware und Assayentwicklungen. Das System kombiniert die Eigenschaften der quantitativen Real-Time-PCR mit einem multiplexen mikropartikelbasiertem Detektionssystem. Es ermöglicht die Genexpressionsanalyse kardialer Marker und Rezeptoren und bietet somit die Möglichkeit, genregulatorische Abläufe von Kardiomyozyten zu analysieren.

The development of effective treatment for cardiac diseases is based on a comprehensive understanding of cell-physiological and gene-regulatory processes of heart muscle cells. Knowledge on gene expression and characteristics of the involved molecules allows conclusions regarding stress mediated reactions. There is a vast number of technologies for gene analysis and characterization of biomolecules. However, most are i) limited in their multiplexing capabilities, ii) tied to a specific task, iii) can not perform temperature controlled real-time applications, iv) have high technical demands and/or v) are cost-intensive. The aim of this thesis was the development of a novel technological platform, designated VideoScan, along with assays to amplify and quantify DNA of human cardiac origin. In order to meet the requirements of modern multiparameter bioanalytics, assays for quantitative measurements of biomolecules in homogenous formats were designed. A competitive edge compared with existing bioanalytical technologies has been achieved by combining the microbead-based VideoScan-technology and standard laboratory technologies such as multiplex qPCR. First of all, methods for the characterization of the material, probe systems and new assay formats were established. Using this information, the novel multiparameter microbead-based technology for gene-expression analysis was characterized and reaction schemes were developed. The VideoScan-technology was extended to perform kinetic data acquisition of multiplex hybridization assays, melting curve analysis and multiplex quantitative real-time PCRs. To analyze the amplification-, hybridization and melting curve data algorithms and plugins were implemented within a statistical software framework. For reproducible performance, microbead-based assays rely on microbeads with homogenous chemical surfaces. A novel, yet simple, fluorescence dye adsorption assay was developed to control routinely both the quality and quantity of the microbead carboxylation. Following this strategy, optimal non-covalent and covalent immobilization methods of biomolecules were developed and DNA probe systems were tested. The present work describes for the first time an overall system consisting of fully characterized microbeads, software for data analysis and bioanalytical assays restate what the system is used for here. The system combines the properties of quantitative real-time PCR and highly multiplex microbead-based detection. The described system enables gene-expression analysis of cardiac markers and receptors and therefore offers tools to analyze gene-regulatory processes of cardiomyocytes.