Shigellosis manifestation is a global health problem. Additionally, emerging drug-resistant strains accentuate the situation. Better understanding of the mechanisms underlying bacterial pathogenesis would provide an edge in developing suitable counter-strategies against pathogenic bacteria. In this respect detailed insight into the structure and function of components essential for bacterial invasion and survival in host cells could provide vital information. Pathogenic Gram negative bacteria have evolved a complex molecular machinery to deliver virulence proteins into the membrane or inside the cytoplasm of the eukaryotic cell. This machinery termed type three secretion system (TTSS) is employed by both animal and plant pathogenic bacteria. Proper assembly and operation of TTSS requires cooperation of multiple pathogenicity associated chaperones. Chaperones have been implicated in many functions ranging from prevention of aggregation and premature association between the interacting components, serving as secretion pilots and role in regulation. Based on the type of the effector binding, chaperones of TTSS have been classified into three groups. The mode of binding and structures from class I and III are well characterized, but there is dearth of information regarding class II chaperones. The aim of this study was to characterize structure and function of a class II chaperone, IpgC from Shigella flexneri. Further to map precisely the chaperone binding domains (CBDs) on its substrates- IpaB and IpaC and to decipher molecular interactions defining their interaction. This study presents the first X-ray structure of a functional class II chaperone, IpgC from Shigella flexneri. The IpgC crystallized was fully functional for secretion, invasion and cytotoxicity when complemented in ipgC deleted Shigella. The crystal structure reveals the biological unit is a dimer in agreement with dimer in solution. It folds into an all-α helical structure with consecutive tetratricopeptide motifs forming a cleft-like scaffold. The crystal structure demonstrates the crucial role of N-terminal helix in the asymmetric dimerization of IpgC. Deletion of the N-terminal helix led to aggregation of the protein and in vivo could not restore the functionality of ipgC deleted Shigella, thereby indicating that dimerization is important for a functional chaperone. Hitherto, largely, the CBDs on the substrates have been characterized using genetic screening and to a lesser extent biochemical methods. By using a combination of methods and techniques the boundaries of the CBDs in IpaB and IpaC were precisely mapped quelling the ambiguity of CBDs presented in the literature. Briefly, the contradicting reports existing regarding the CBD in IpaC was addressed, while for IpaB not only was the boundary of the known CBD redefined but also an additional CBD was mapped. Further this study presents the first co-crystal structure of class II chaperone with its substrate. Crystals of IpgC in complexes with CBDs of IpaC and IpaB were obtained and the structure of IpaB CBD-bound IpgC was solved. The chaperone captures the CBD in an extended conformation stabilized by conserved residues lining the cleft. Analysis of the co-crystal structure reveals specific interactions which define how the substrate is bound. Importantly a sequence motif in substrates recognized by class II chaperones was identified. Consequentially the generality of the sequence motif which extends and holds true for other homologue substrates of class II chaperones was confirmed. Further this study shows how virulence factors are chaperoned. It significantly advances our understanding on this class of chaperone hitherto unavailable.
Shigellen sind Gram-negative pathogene Bakterien, die beim Menschen das Krankheitsbild der bakteriellen Ruhr hervorrufen. Bakterienruhr stellt speziell in Entwicklungsländern ein massives Gesundheitsproblem dar. In Westeuropa sind bakteriell verursachte Infektionskrankheiten in den letzten Jahren wieder auf dem Vormarsch, was auf die Verbreitung Antibiotika- resistenter Bakterienstämme speziell aus dem östlichen Europa zurückzuführen ist. Ein besseres Verständnis bakterieller Virulenzmechanismen ist mithin grundlegend für die Entwicklung neuer Medikamente. Shigellen, wie auch viele andere Gram-negative Krankheitserreger, besitzen einen Multi-Protein-Komplex, um spezifisch Effektorproteine in die Membran sowie das Zytoplasma eukaryontischer Wirtszellen zu transportieren. Dieser transmembrane Proteinkomplex, genannt Typ III Sekretionssystem (TTSS), ist essentiell für die Pathogenität vieler human-, tier- als auch pflanzenspezifischer pathogener Bakterien. Aufbau und Funktion dieses Proteintransportsystems erfordert ein Zusammenspiel mehrerer Chaperone, die zusammen mit anderen Komponenten des TTSS im Bakteriengenom kodiert sind. Diese Chaperone erfüllen so vielfältige Funktionen wie die die Verhinderung der vorzeitigen Aggregation sowie Assoziation interagierender Proteine und spielen bei der Sekretion der Effektoren eine wichtige regulatorische Rolle. Abhängig von der Art der Effektorbindung werden Chaperone des TTSS in 3 Klassen eingeteilt (I-III). Bindemechanismus sowie der strukturelle Aufbau der Klasse I- und III-Chaperone sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Über Klasse II-Chaperone hingegen ist wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die 3-dimensionale Struktur und die Funktion des Klasse II-Chaperons IpgC aus Shigella flexneri untersucht. Darüber gelang es, die Chaperon-Bindedomäne (CBD) der Substrate IpaB und IpaC zu indentifizieren und deren Wechselwirkungen mit dem Chaperon strukturell und funktionell zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wird die erste Kristallstruktur des funktionellen Klasse II-Chaperons IpgC vorgestellt. Die zur Kristallisation benutzte Mutante ist hinsichtlich Sekretion, Invasion und Zytotoxizität voll funktionsfähig im IpgC- Deletionsstamm. Die Kristallstruktur zeigt ein IpgC-Dimer. Dies ist in Übereinstimmung mit hier durchgeführten Lichtstreuexperimenten in Lösung, in denen ebenfalls ein Dimer gefunden wurde. IpgC weist eine vorwiegend α-helicale Struktur auf, der ein sich wiederholendes Tetratricopeptid-Motif zur Grunde liegt. Die Kristallstruktur zeigt, dass die N-terminale Helix eine wichtige Rolle in der asymmetrischen IpgC-Dimerisierung spielt. Deletion der N-terminalen Helix führt zur Proteinaggregation in vitro und zu Funktionsverlust von IpgC in vivo. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Dimerisierung essentiell für die Funktionalität des Chaperons und folglich die Funktion des gesamten TTSS ist. Bisher wurden CBDs vorwiegend über genetische Screens sowie biochemische Methoden grob charakterisiert. In dieser Arbeit konnten durch den Einsatz mehrerer Techniken die Lokalisierungen der CBDs in IpaB und IpaC genauer kartiert werden. Im Fall von IpaB konnte darüber hinaus und zusätzliche CBD identifiziert werden. Auf der Basis der gewonnenen Chaperon-Substrat-Interaktionen wurden im Rahmen dieser Arbeit Kokristalle von IpgC im Komplex mit den CBDs von IpaC sowie IpaB erhalten. Die Struktur der IpaB-CBD gebunden an IpgC wurde mittels Röntgenstrukturanalyse gelöst. IpgC stabilisiert die CBD in einer ungewöhnlichen Konformation, die durch konservierte Reste innerhalb des TPR-Motifs stabilisiert wird. Basierend auf der Kokristallstruktur wurde ein Sequenzmotif identifiziert, das von verschiedenen Klasse II-Chaperonen spezifisch erkannt wird. Insgesamt zeigt diese Studie, wie Virulenzfaktoren von ihren Chaperonen gebunden werden. Sie erweitert unser Verständnis über diese Chaperon-Gruppe.
