Immunohistologische Detektion von Parvovirus B19 (B19V) Kapsid-Proteinen und B19V-spezifische Antikörper-Profile bei Patienten mit akuter Myokarditis und dilatativer Kardiomyopathie

Abstract

Die inflammatorische Kardiomyopathie (DCMi) stellt ein komplexes Krankheitsbild dar, welches durch vielfältige und verschiedene Ätiologien induziert und unterhalten werden kann. Der klinische Verlauf kann akut oder chronisch sein. Ein Progress von der akuten Myokarditis (AMC) zur chronischen dilatativen Kardiomyopathie (DCM) ist möglich, wenngleich die dafür wesentlich ausschlaggebenden Mechanismen nicht detailliert bekannt sind. Die akute Infektion durch kardiotrope Viren, und die Viruspersistenz, scheinen nach der aktuellen Datenlage eine entscheidende Rolle zu spielen. Das B19V wurde in mehreren unabhängigen Untersuchungen mittels hochsensitiver nPCR (nested PCR) Methoden als häufigstes Virus in den Endomyokardbiopsien (EMBs) von AMC- und DCM-Patienten nachgewiesen. Bislang waren jedoch detaillierte Kenntnisse über das B19V Infektionsmuster im Herzmuskelgewebe ausstehend. Des Weiteren ist die humorale Antwort gegen B19V in diesem Patientenkollektiv nicht eingehend untersucht worden. In dieser Arbeit untersuchten wir einerseits die Bedeutung von B19V-spezifischen IgG- und IgM- Antikörpern gegen native VP2-Kapside und denaturierte VP1-, VP2- und NS1-Proteine bei Patienten mit dem klinischen Verdacht auf AMC und DCM, um die Differenzierung des viralen Infektionsstadiums bei diesen Patientenkollektiven zu ermöglichen. B19V- spezifische IgG- und IgM-Antikörper wurden mit Hilfe von „recomLine® Blots“ in den Seren von 62 (n=33 AMC- und n=29 DCM-) Patienten untersucht. Bei der Amplifikation von B19V-Genomen in EMB mittels nPCR wurden positive Ergebnisse bei 63,6% der AMC- und 51,7% der DCM-Patienten beobachtet. IgM-Antikörper wurden ausschließlich bei AMC-Patienten (18,1%) detektiert. Der B19V-nPCR Nachweis in EMBs war mit der Prävalenz von B19V-spezifischen IgGs in den Seren assoziiert (p<0,0001). Bei Patienten mit gesicherter myokardialer B19V- Infektion waren Antikörper-Profile für kurz zurückliegende Infektionen häufiger bei AMC- (47,6%) im Vergleich zu DCM- (6,7%) Patienten. Die Prävalenz reaktivierender/persistierender Profile war signifikant häufiger bei DCM- (20%) im Vergleich zu AMC- (0%) Patienten (p<0,05). Des Weiteren untersuchten wir die Detektierbarkeit und das zelluläre Expressionsmuster von B19V-Protein in EMBs von DCM-Patienten mittels Immunhistochemie (IHC), und deren Assoziation mit dem etablierten nPCR-Nachweis von B19V-Genomen in EMBs. Die B19V-VP1/VP2-Expression wurde immunhistochemisch unter Verwendung des bei anderen B19V-assoziierten Erkrankungen gut charakterisierten Klons R92F6 in den EMBs von 30 DCM-Patienten bestimmt. Die Spezifität dieses Antikörpers wurde auf pB19-M20 transfizierten HEK293T Zellen untersucht. Es bestand eine signifikante Assoziation zwischen der positiven anti-B19V-IHC (46,6%) und nPCR-positivem B19V-Genom-Nachweis (50%) (p=0,003). Im Vergleich zu den B19V- nPCR-Ergebnissen wurde eine Sensitivität von 80% und eine Spezifität von 86% für die anti-B19V-VP1/VP2 IHC beobachtet. Dies entsprach einem positiven prädiktiven Wert von 85,7% und einem negativen prädiktiven Wert von 81,2%. Das Expressionsprofil von IHC-detektierten B19V-Protein-exprimierenden Zellen umfasste in allen Fällen interstitielle Zellen, und nur in Einzelfällen Endothelzellen (1 Fall) und Kardiomyozyten (4 Fälle). Aus dieser Studie können folgende Schlußfolgerungen gezogen werden: B19V-IgM-Antikörper lassen sich grundsätzlich bei AMC-, aber nicht DCM-Patienten nachweisen. Die Detektion der B19V-Antikörper ermöglicht eine klinisch bedeutsame Bestimmung des Infektionsstadiums (akute versus chronisch und persistierende/reaktivierende) bei Patienten mit nachgewiesener myokardialer B19V-Infektion. Die immunhistochemische Detektion von B19V-VP1/VP2-Expression bei DCM-Patienten ist mit dem nPCR Genom-Nachweis signifikant assoziiert, und stellt daher eine valide Methode dar, um das B19V-Expressionsprofil in EMBs von AMC- und DCM- Patienten zu untersuchen Auf der Basis dieser methodischen Grundlagen bleibt es künftigen Studien vorenthalten zu untersuchen, welche prognostische Bedeutung diese Detektions- und Charakterisierungsmethoden für den natürlichen Verlauf der DCMi (Viruselimination versus –persistenz), und für die Auswahl von immunmodulatorischen Therapieregimes bei DCMi-Patienten haben (Immunsuppression, antivirale Interferon-Therapie, Immunadsorption).

Inflammatory cardiomyopathy (DCMi) is a complex disease which can be induced and sustained by a multiplicity of different etiologies. The clinical course can be acute or chronic. A progression from acute Myokarditis (AMC) to chronic dilated cardiomyopathy (DCM) is possible, although the detailed mechanisms are not well known. Acute Infection with cardiotropic viruses and virus persistence seem to play a vital role. Parvovirus B19 (B19V) has been identified as the most common virus in endomyocardial biopsies (EMBs) from acute myocarditis (ACM) and dilated cardiomyopathy (DCM) patients by nPCR techniques. To date the infection pattern of B19V in the heart muscle tissue and the humoral response against B19V have not been well examined. We examined the role of B19V specific IgG and IgM antibodies against native VP2-capsids and denatured VP1-, VP2- and NS1-proteins in patients presenting with clinically suspected AMC and DCM, for the determination of the infection stage. B19V-specific IgG- and IgM-antibodies were analysed with â recomLine® Blotsâ in the sera of 62 (n=33 AMC- and n=29 DCM-) Patients. The amplification of B19V-genoms in EMB by nPCR yielded positive results in AMC- (63.6%) and DCM-Patients (51.7%). IgM antibodies were only detected in AMC- Patients (18.1%). The detection of B19V in EMBs by nPCR was associated with the prevalence of B19V specific IgGs in sera (p<0.0001). In Patients with myocardial B19V infection antibody profiles indicating recent infections were more frequent in AMC (47.6%) compared to DCM (6.7%) patients. The prevalence of reactivating/persistent profiles was significantly higher in DCM (20%) compared to AMC (0%) patients (p<0.05). Furthermore we analyzed EMBs from 30 DCM patients by nPCR for B19V genomes, and the expression of B19V VP1/VP2 by IH was carried out using the antibody clone R92F6. The specificity of this antibody was investigated on 293T cells transfected with pB19-M20. Positive anti-B19V IH staining (positive in n=14/46.6%) and nPCR proof of B19V genomes (positive in n=15/50%) were significantly associated (p=0.0003). Compared to the B19V nPCR results, the sensitivity of anti-B19V-VP1/VP2 IH was 80.0%, and the specificity was 86.0%. B19V immunostaining was observed on interstitial cells in all IH positive cases, and was noted additionally on endothelial cells in 1, and on cardiomyocytes in 4 cases. From this study we can conclude that B19V IgM antibodies can basically be detected in AMC, but not in DCM Patients. The detection of B19V antibodies enables a clinically meaningful determination of the infection stage (acute versus chronic and persistent/reactivating) in patients with myocardial B19V infection. The immunhistochemical detection of B19V VP1/VP2 expression provides a high association with the nPCR proof of B19V genomes in DCM patients. IH detection of B19V proteins enables a differentiation of B19V VP1/VP2 expressing cells within the myocardium. Further studies will be needed to determine the prognostic value of this detection and characterization methods on the natural course of DCMi (virus elimination versus persistence), and on the choice of the immunmodulatory therapy regimes in DCMi patients (immune suppression, antiviral interferon therapy, immune adsorption).