Die starke Zunahme an DNA-basierten Nachweismethoden seit Erfindung der PCR und der Entwicklung der Real-Time PCR setzt sich auch vermehrt in der Lebensmittelüberwachung durch. Die vorliegende Arbeit umfasst den molekularbiologischen Nachweis mehrerer pathogener Keime aus Lebensmitteln. Veröffentlichte Methoden wurden evaluiert und darauf aufbauend optimierte Schnellverfahren entwickelt. Der Nachweis von Salmonella spp. mittels PCR wurde für den Einsatz in der amtlichen Überwachung etabliert. Zusätzlich wurde er als Real-Time PCR weiterentwickelt und umfassend validiert. Diese zeigte eine hohe Spezifität und Sensitivität. Pro Ansatz konnten weniger als 5 Keime pro 25 g Lebensmittel nach Anreicherung detektiert werden. Diese Real-Time PCR wurde mit einer neu entwickelten internen Amplifikationskontrolle als Duplex- Real-Time PCR etabliert. In weiterführenden Arbeiten wurde sie in einem Ringversuch validiert, und stellt als Teil der Methodensammlung nach §64 LFGB eine offizielle Untersuchungsmethode dar. Zur genauen Typisierung von Salmonella-Serovaren wurde zudem die PFGE getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass sie das passende Werkzeug für eine differenzierte epidemiologische Untersuchung darstellt. PCR und Real-Time PCR können für die amtliche Überwachung zum raschen Screening eingesetzt werden, an das sich eine molekularbiologische Serotypisierung mittels PFGE anschließen kann. Der Nachweis von thermophilen Campylobactern wurde mittels PCR etabliert und zudem eine Real-Time PCR neu entwickelt. Diese Methode zeigte eine Exklusivität von 100% und eine Inklusivität von 98,1% und damit statistisch eine fast vollständige Übereinstimmung. Die Nachweisgrenze für die Real-Time PCR lag bei ca. 5 DNA-Kopien pro Ansatz. Im Vergleich mit der kulturellen Methode konnten ebenfalls weniger als 5 Keime pro 25 g Lebensmittel sicher nachgewiesen werden. Für die beiden Real-Time PCRs wurde zur Vermeidung falsch-negativer Ergebnisse eine Amplifikationskontrolle neu entwickelt, kloniert und etabliert. Für beide Methoden wurden mit interner und externer Inhibitionskontrollen unterschiedliche Strategien verfolgt. Des weiteren wurde der molekularbiologische Erregernachweis für Listeria monocytogenes etabliert und ein Microarray zum Nachweis von drei Keimen, Salmonella spp., C. jejuni/coli sowie L. monocytogenes ausgetestet. Zusammenfassend zeigten die PCRs und Real-Time PCRs eine hohe Spezifität und Sensitivität. Gerade die Real-Time PCR bietet für die amtliche Überwachung eine schnelle und verlässliche Detektion pathogener Keime. Dabei ermöglicht die interne Amplifikationskontrolle falsch-negative Ergebnisse auszuschließen. Im Rahmen der Arbeit wurden mehrere solcher Methoden entwickelt, bzw. weiterentwickelt, validiert und in die Überwachung eingeführt. Eine rasche und zuverlässige Erkennung von Infektionserregern ermöglicht es, Lebensmittel, von denen eine gesundheitliche Gefährdung ausgeht, schnellstmöglich aus dem Verkehr zu ziehen.
Since the invention of the PCR and Real-Time PCR methods, their use in food control and surveillance has increased tremendously. The present study details the detection of several pathogenic microorganisms in food by PCR and Real- time PCR. Published methods were evaluated and modified and new methods developed. Their sensitivity, specificity and practicability were tested. For the detection of Salmonella spp. a PCR was established and developed further as a Real-Time PCR. This method was comprehensively compared to the cultural method using artificially and naturally contaminated samples. It showed a high specificity and sensitivity and generally yielded the same results as the cultural method. This Real-Time PCR was then combined and validated as a duplex PCR with a newly developed internal amplification control. In further work, this duplex-Real-Time PCR has been validated in a collaborative study in Germany and now represents an official diagnostic method according to §64 LFGB. Furthermore PFGE was used for a thorough typing of Salmonella serovars. It showed itself a precise tool to gain detailed information for epidemiological conclusions. PCR and Real-Time PCR can be used for fast screening in governmental food control and can be followed by exact identification and molecular biological typing with PFGE. Additionally the detection of Campylobacter jejuni and coli with PCR was established and a new Real-Time PCR was developed. This method was similarly validated as the above. The comparison of the Real-Time PCR with the cultural method resulted in an exclusivity of 100% and an inclusivity of 98,1%, which means almost complete concordance. The limit of detection for the Real-Time PCR was found to be about 5 copies DNA per sample. Compared with the cultural method, both methods were able to reliably detect less than 5 cfu per 25 g food. To prevent false- negative results, an amplification control was developed, cloned and established for the Real-Time PCR for Salmonella spp. as well as for Campylobacter coli/jejuni. For the different Real-Time PCR methods, either an internal or an external inhibition control were used. Furthermore the detection of Listeria monocytogenes using nucleic acid based methods was tested, comparing the PCR and Real-Time PCR with a microarray. All three methods showed similar results. In summary both the PCRs and the Real-Time PCR showed a high specificity as well as sensitivity. The Real-Time PCR in particular offers very fast and reliable detection of bacterial pathogens. In addition the new internal amplification control reliably excludes false- negative samples. Within the scope of this work several methods to detect pathogenic microorganisms in food were developed, refined and implemented in food surveillance. Fast detection of bacterial pathogens ensures that food products that present a health risk or hazard to consumers can quickly be withdrawn from public consumption.
