Presynaptic regulation of neurotransmitter release: RIM-binding protein 2 sets release probability by fine-tuning Ca2+ channel localization

Abstract

Fast neuronal communication is fundamental to sensory information processing and all cognitive function in the brain, including memory formation and retrieval. The necessary temporal and spatial precision of neurotransmitter- based information transfer can only be achieved by a highly efficient synaptic vesicle release machinery combined with an exceptionally accurate spatial arrangement of the sites of calcium entry. The presynaptic area of neurotransmitter release is called the active zone. It comprises the key proteins fundamental to both these prerequisites, including Rab3-interacting molecules (RIMs), Munc13s, α-liprins, ELKS, piccolo, bassoon and RIM binding proteins (RIM-BPs). We were interested in the role of RIM-BPs in neurotransmitter release for three reasons: First, RIM BPs have been shown to bind to RIMs, Bassoon and voltage-gated calcium channels. Second, at the Drosophila melanogaster neuromuscular junction RIM-BP is crucial for presynaptic ultrastructure, calcium channel coupling and neurotransmitter release. Third, RIM-BPs have been associated with autism spectrum disorders (ASD), however, until recently little was known about their exact function in vertebrate central synapses. In this study we set out to elucidate the role of RIM-BP1 and RIM-BP2 in neurotransmitter release at murine hippocampal synapses. We investigated knockout (KO) mouse lines lacking RIM-BP1, RIM BP2 or both proteins and compared neurotransmission in neurons from WT and KO animals. We focused mainly on RIM-BP2 as RIM-BP2 had higher expression levels than RIM-BP1 in hippocampal neurons and initial electrophysiological characterization indicated a more important functional role of RIM-BP2 as well. First, we assessed basic electrophysiological parameters in glutamatergic hippocampal neurons grown in autaptic cell culture (Grauel et al., 2016; Fig. 1B-K). Evoked release and vesicular release probability (PVR) were significantly reduced, while the size of the readily-releasable pool (RRP) of fusion-component vesicles and spontaneous release were unaltered in RIM-BP2-deficient synapses. Measurements of the paired-pulse ratio (PPR) of evoked transmitter release and responses to train stimulations showed a strong facilitation compared to WT, supporting the hypothesis of a reduced release probability. We independently verified this phenotype in recordings from area CA1 of acute hippocampal slices, underlining the validity of the results (Grauel et al., 2016; Fig. 2). Initial recordings in RIM-BP1-deficient cultured neurons did not reveal any detectable effect of RIM BP1 deletion on synaptic transmission (unpublished data). Since this could be due to a functional redundancy of RIM-BP1 and RIM-BP2 we analyzed neurotransmission in area CA1 of acute hippocampal slices of RIM-BP1/2 DKO animals (Grauel et al., 2016; Fig. S4G-I). We could not detect a significant difference in the PPR or short-term plasticity of RIM BP2 KO and RIM-BP1/2 DKO animals, demonstrating that RIM BP2 does not functionally substitute for RIM-BP1 and that RIM BP2 is indeed the more relevant isoform in these hippocampal neurons. The observed reduction in release probability and increase in facilitation could be explained by either an impairment in the molecular priming of synaptic vesicles or a deficiency in the spatial coupling of calcium channels to release sites, also termed 'positional priming'. The analysis of spontaneous release rates, fusogenicity and release kinetics of the RRP in autaptic hippocampal neurons largely excluded a role of RIM-BP2 in molecular priming (Grauel et al., 2016; Fig. S3D-G). We next analyzed parameters that could point to an impairment of positional priming (Grauel et al., 2016; Fig. 3). The global calcium influx into presynaptic terminals, assessed by calcium imaging using SynGCamp6f, was not reduced in RIM BP2 neurons. However, due to the limited spatial resolution of the technique, the results cannot exclude changes in the local calcium signal in the vicinity of the calcium sensor synaptotagmin. We examined the dependence of neurotransmitter release on external calcium concentrations (Grauel et al., 2016; Fig. 3D-G). The Hill function fit indicated that the number of calcium channels and calcium cooperativity of release was largely unaffected by RIM-BP2 deletion. However, the significant alterations in PVR and PPR seen at lower external calcium concentrations in RIM BP2 KO neurons were rescued by increasing external calcium concentrations above physiological levels. These data suggest that there is indeed an impairment of calcium secretion coupling in the RIM- BP2-deficient synapses. Next, we evaluated calcium channel localization at the presynaptic active zone using superresolution light microscopy in mouse brain cryosections (Grauel et al., 2016; Fig. 4). Dual- and triple-channel time- gated stimulation emission depletion (gSTED) microscopy for Bassoon and P/Q-type calcium channels (CaV2.1), as well as RIM1, CaV2.1 and the postsynaptic marker Homer1 showed that the relative localization of the presynaptic active zone marker Bassoon and CaV2.1s was indeed altered in the absence of RIM-BP2, suggesting an impairment of the subsynaptic localization of calcium channels. Functionally, this altered localization resulted in an increased coupling distance between the calcium channels and the calcium sensor for release, as judged by the stronger effect of the membrane-permeable calcium chelator EGTA-AM on EPSC amplitudes and PVR in RIM-BP2-deficient neurons (Grauel et al., 2016; Fig. S6). In summary, our data shows that at murine glutamatergic hippocampal synapses RIM-BP2 supports the precise positioning of calcium channels within the active zone and thereby assures appropriate synaptic function. In the absence of RIM-BP2 the fine positioning of calcium channels is altered, albeit moderately, which reduces release probability and changes short-term plasticity properties of these synapses. In particular the latter phenotype could provoke significant alterations in the computational properties of the neuronal network and therefore underlie neurological disorders, such as ASD, associated with mutations in RIM-BP genes.

Effiziente neuronale Kommunikation ist eine Grundvoraussetzung für Informationsverarbeitung und jegliche kognitiven Prozesse im Gehirn. Die hierfür notwendige zeitliche und räumliche Präzision des neurotransmitterbasierten Informationstransfers kann nur durch die Kombination einer höchsteffizienten Freisetzungsmaschinerie mit einer akkuraten räumlichen Kopplung der Kalziumkanäle und der Freisetzungsstellen erreicht werden. Der hochspezialisierte präsynaptische Bereich, in dem neurotransmittergefüllte synaptische Vesikel mit der Plasmamembran fusionieren, wird aktive Zone genannt. Sie wird aus einer Reihe von Proteinen gebildet, die für diese Funktionen unbedingt erforderlich sind. Dazu gehören unteranderem Rab3-interacting molecules (RIMs), Munc13s, α-liprins, ELKS, piccolo, bassoon and RIM binding proteins (RIM-BPs). Wir waren aus drei Gründen insbesondere an der Rolle von RIM-BPs bei der Freisetzung von Neurotransmittern interessiert: Erstens interagieren RIM-BPs mit RIMs, Bassoon und spannungsabhängigen Kalziumkanälen. Zweitens ist RIM-BP essenziell für die Integrität der präsynaptischen Ultrastruktur, sowie die räumliche Kopplung spannungsabhängiger Kalziumkanäle und Neurotransmitterfreisetzung an der neuromuskulären Synapse von Drosophila melanogaster. Drittens wurden RIM-BPs in mehreren Studien mit Autismus-Spektrum-Störungen in Verbindung gebracht. Dennoch war bis vor kurzem wenig über die exakte Funktion dieser Proteinfamilie in zentralen Synapsen von Wirbeltieren bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von RIM-BP1 und RIM-BP2 in der Neurotransmitterfreisetzung an murinen hippocampalen Synapsen zu untersuchen. Hierfür haben wir Knockout (KO)-Mauslinien für RIM-BP1 und RIM-BP2, sowie eine RIM-BP1/2 Doppel-KO-Mauslinie generiert und die Neurotransmitterfreisetzung in Wildtyp (WT)- und KO-Neuronen verglichen. Wir haben uns vor allem auf RIM-BP2 konzentriert, da RIM-BP2 in hippocampalen Neuronen höhere Expressionslevel aufwies als für RIM-BP1 und eine anfängliche elektrophysiologische Charakterisierung darauf hinwies, dass RIM-BP2 auch funktionell eine wichtigere Rolle in diesem Neuronentyp spielt als RIM-BP1. Zunächst haben wir eine grundlegende elektrophysiologische Charakterisierung RIM-BP2-defizienter glutamaterger hippocampaler Neurone vorgenommen (Grauel et al., 2016; Fig. 1B-K). Die evozierte Glutamatfreisetzung (EPSC) und die vesikuläre Freisetzungswahrscheinlichkeit (PVR) war signifikant vermindert, während die Größe des Pools fusionskompetenter synaptischer Vesikel (readily-releasable pool, RRP) und die spontane Neurotransmitterfreisetzung unverändert waren. Messungen der Neurotransmitterfreisetzung bei Stimulation mit zwei Pulsen (Paired-Pulse Ratios (PPR)) oder mit 50 Pulsen bei 10 Hz zeigten eine stärkere Faszilitierung als in WT-Neuronen. Dies stützt die Hypothese, dass die Freisetzungswahrscheinlichkeit in RIM-BP2 KO-Neuronen reduziert ist. Wir haben diese Ergebnisse in Messungen in der CA1-Region akuter hippocampaler Schnitte unabhängig verifiziert. Dies unterstreicht zusätzlich die Validität der Ergebnisse (Grauel et al., 2016; Fig. 2). Anfängliche Messungen in RIM- BP1-defizienten Neuronen offenbarten keinen signifikanten Phänotyp (unveröffentlichte Daten, siehe Figure 6, Introduction). Wir haben daher die Neurotransmission in akuten hippocampalen Schnitten RIM-BP1/2 defizienter Tiere analysiert, um eine mögliche funktionelle Redundanz von RIM-BP1 und RIM- BP2 zu untersuchen (Grauel et al., 2016; Fig. S4G-I). Wir konnten jedoch keinen Unterschied zwischen RIM-BP2 KO und RIM-BP1/2 DKO hinsichtlich der PPR oder der Kurzzeitplastizität feststellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass RIM- BP2 RIM-BP1 nicht funktionell ersetzen kann und RIM-BP2 tatsächlich die funktionell relevantere Isoform in hippocampalen Neuronen darstellt. Der beobachteten Reduktion der Freisetzungswahrscheinlichkeit in RIM- BP2-defizienten Neuronen könnte ein Defekt entweder im molekularen Priming der synaptischen Vesikel oder in der räumlichen Kopplung von spannungsabhängigen Kalziumkanälen (Positional Priming) und Freisetzungsstellen zugrunde liegen. Die Analyse der spontanen Freisetzungsrate, sowie der Fusogenizität und der Freisetzungskinetiken des RRP in autaptischen hippocampalen Neurone schloss eine Funktion von RIM-BP2 im Molecular Priming weitestgehend aus (Grauel et al., 2016; Fig. S3D-G). Als Nächstes analysierten wir Parameter, die auf einen Defekt im Positional Priming hindeuten könnten (Grauel et al., 2016; Fig. 3). Der globale Kalziumeinstrom in die Präsynapse RIM-BP2-defizienter Neurone, gemessen mithilfe von SynGCamp6f, war jedoch nicht verändert. Aufgrund der begrenzten räumlichen Auflösung dieser Methode können diese Ergebnisse jedoch nicht mögliche Veränderungen im lokalen Kalziumprofil in der unmittelbaren Umgebung des Kalziumsensors Synaptotagmin ausschließen. Des weiteren haben wir die Abhängigkeit der Neurotransmitterfreisetzung von der externen Kalziumkonzentration untersucht. Das Hill-Diagramm zeigte, dass die Gesamtanzahl der Kalziumkanäle, sowie die Kalziumkooperativität der Neurotransmitterfreisetzung in RIM-BP2 KO Neuronen nicht beeinträchtigt war. Die signifikanten Unterschiede der PVR und PPR zwischen WT-und RIM-BP2 KO- Neuronen in niedrigen Kalziumkonzentrationen verschwanden jedoch, wenn die externen Kalziumkonzentrationen über ein physiologisches Niveau angehoben wurde. Diese Resultate zeigen, dass in RIM-BP2-defizienten Synapsen tatsächlich ein Defekt in der Kopplung von Kalziumeinstrom und Neurotransmitterfreisetzung vorliegt. Schließlich haben wir die Lokalisierung der Kalziumkanäle an der präsynaptischen aktiven Zone mittels Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie in Kryoschnitten von WT und RIM-BP2 KO Mausgehirnen untersucht (Grauel et al., 2016; Fig. 4). Zweikanal und Dreikanal- STED-Mikroskopie für Bassoon und den P/Q-Typ spannungsabhängiger Kalziumkanäle (CaV2.1), sowie RIM1, CaV2.1 und das postsynaptische Markerprotein Homer1 zeigten, dass die relative Lokalisation des aktiven Zonen Markers Bassoon und der CaV2.1-Kanäle in Abwesenheit von RIM-BP2 tatsächlich verändert war. Diese Ergebnisse deuten auf einen Defekt in der subsynaptischen Lokalisierung der Kalziumkanäle hin. Funktionell resultierte dies in einer erhöhten Kopplungsdistanz zwischen Kalziumkanälen und Kalziumsensor, verdeutlicht durch den stärkeren Effekt des langsamen Kalziumchelators EGTA-AM auf EPSC und PVR in RIM-BP2-defizienten Neuronen. Zusammengefasst zeigen unsere Ergebnisse, dass in murinen glutamatergen hippocampalen Synapsen RIM- BP2 die präzise Positionierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle in der aktiven Zone aufrechterhält. Dadurch gewährleistet RIM-BP2 die adäquate Funktion der Synapse. Fehlt RIM-BP2, führt dies zu einer moderaten Veränderung in der Feinpositionierung der Kalziumkanäle. Diese wiederum resultieren in einer signifikanten Verminderung der initialen Freisetzungswahrscheinlichkeit und Veränderungen in den Kurzzeitplastizitätseigenschaften dieser Synapsen. Insbesondere die veränderte Kurzzeitplastizität könnte eine signifikante Auswirkung auf die Eigenschaften des neuronalen Netzwerks zur Folge haben und somit den neurologischen Störungen zugrunde liegen, die mit Mutationen in den RIM-BP-Genen in Verbindung gebracht werden.