C-type lectin receptors (CLR) and their carbohydrate ligands are involved in several different inflammatory processes. Still, for some CLRs, ligands need to be identified and the impact of CLR-ligand interactions on the immune response is not known for the majority of CLRs. The aim of this PhD thesis was to establish a platform to facilitate screening of CLR-ligand interactions and to analyze their impact in vitro and in vivo. To this end, the extracellular regions of MGL1, Clec9a and SIGNR3 were expressed as fusion proteins with the Fc part of human IgG1. Fusion proteins were produced in CHO cells followed by their biochemical characterization. Binding of CLR-hFc fusion proteins to synthetic carbohydrate ligands was screened using glycan array. Three candidate carbohydrate ligands binding to MGL1-hFc were selected for analysis in vitro and in vivo and were conjugated to ovalbumin (OVA). Pulsing dendritic cells with OVA carbohydrate conjugates before co-culture with OT-II T cells resulted in an increased IL-2 and IFN-γ production by T cells. Similarly, by trend an increase of the IL-2 and IFN-γ producing T cell populations was detected upon immunization with OVA-carbohydrate conjugates. In addition, the production of OVA-specific antibodies was reduced in mice immunized with OVA- carbohydrate conjugates. These findings demonstrate that it is possible to use CLR carbohydrate ligands to influence OVA-specific T cell responses in vitro and in vivo. Moreover, this platform is a suitable tool to identify CLR carbohydrate ligands with immune modulatory properties. Recent observations suggest that the interaction of gut microbes and certain CLRs, such as Dectin-1 and MGL1, influence the intestinal inflammation. To analyze whether further CLRs recognize gut commensals, the generated CLR-hFc proteins were used to screen for microbiota ligands. One CLR-hFc fusion proteins that bound to fungi in the microbiota was SIGNR3. To analyze if this interaction impacted the intestinal immunity against microbiota, the dextran sulfate sodium (DSS) model of colitis was employed. SIGNR3-/- mice exhibited an increased weight loss associated with more severe colitis symptoms compared to wild-type control mice. The increased inflammation in SIGNR3-/- mice was accompanied by a higher level of TNF-α in colon. These findings highlight the importance of CLRs in intestinal immunity and demonstrate for the first time an immune regulatory role for SIGNR3 in colitis. To conclude, well characterized CLR-hFc fusion proteins are useful tools for the identification of novel carbohydrate ligands as well as microbial ligands. In vitro stimulation assays along with immunization studies revealed the immune modulatory role of certain carbohydrate ligands. In addition, an immune regulatory role of the CLR SIGNR3 in murine intestinal inflammation during colitis was discovered. Together these findings highlight the importance of CLRs and their ligand recognition in innate immunity.
C-Typ Lektinrezeptoren (CLRs) und ihre Kohlenhydrat-Liganden sind bei der Entstehung der Mehrzahl von Entzündungsherden beteiligt. Liganden sind für einige CLRs jedoch noch nicht identifiziert und auch der Einfluss der CLR- Liganden-Interaktion auf die Immunantwort ist für die meisten CLRs nicht geklärt. Ein Ziel dieser Doktorarbeit war die Etablierung einer Plattform von CLR-hFc Fusionsproteinen, um in kurzer Zeit eine Mehrzahl von Interaktionen zwischen CLRs und möglichen Liganden zu testen und deren Bedeutung in vitro und in vivo zu analysieren. Zu diesem Zweck wurden MGL1, Clec9a und SIGNR3 als Fusionsproteine bestehend aus der jeweiligen extrazellulären Region und dem humanen IgG1 Fc-Teil exprimiert. Die Fusionsproteine wurden in CHO-Zellen produziert und anschließend biochemisch charakterisiert. Mittels Glykan-Array- Technologie wurden sie dann auf ihre Bindung zu synthetischen Kohlenhydrat- Liganden untersucht. Drei Kohlenhydrat-Liganden zeigten hierbei positive Bindungen zu MGL1. Sie wurden für weitere in vitro und in vivo Analysen ausgewählt und zu diesem Zweck an Ovalbumin (OVA) konjugiert. Nach Beladung von dendritischen Zellen mit den OVA-Kohlenhydrat-Konjugaten und anschließender Ko-Kultivierung mit OT-II T-Zellen zeigte sich eine erhöhte IL-2 und IFN-γ Produktion durch die T-Zellen. Die Immunisierung von Mäusen mit den OVA-Kohlenhydrat-Konjugaten ergab tendenziell ebenfalls eine erhöhte Anzahl an IL-2 und IFN-γ produzierenden T-Zellpopulationen. Weiterhin war die Produktion von OVA-spezifischen Antikörpern in den mit den OVA-Kohlenhydrat- Konjugaten immunisierten Mäusen geringer. Diese Ergebnisse zeigen, dass die OVA-Kohlenhydrat-Konjugate die T-Zellantwort in vitro und in vivo beeinflussen können. Daher ist die im Rahmen dieser Doktorarbeit etablierte Plattform sehr nützlich, um CLR-Liganden mit immunmodulierenden Eigenschaften zu identifizieren. Kürzlich erschienene Publikationen weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Mikroorganismen im Darm und bestimmten CLRs, wie z.B. Dectin-1 und MGL1, einen Einfluss auf die Entzündungsentstehung im Darm im Colitis-Verlauf haben. Um zu untersuchen, ob noch weitere CLRs kommensale Darm-Mikroorganismen erkennen, wurden die im Rahmen dieser Doktorarbeit generierten CLR-hFc Fusionsproteine auf Bindung zu Darmmikrobiota getestet. Hierbei wies SIGNR3 eine positive Bindung auf. Um zu untersuchen, ob diese Interaktion Einfluss auf die darmassoziierte Immunität gegen Mikrobiota hat, wurde das Dextran-Natriumsulfat (DSS)-induzierte Colitis-Modell in der Maus verwendet. Hierbei wiesen die SIGNR3-/- Mäuse im Vergleich zu den Wildtyp- Mäusen einen erhöhten Gewichtsverlust auf, der einher ging mit stärker ausgeprägten Colitis-typischen Symptomen. Der erhöhte Entzündungsgrad in SIGNR3-/- Mäusen war verbunden mit im Darm lokal vermehrter TNF-α Produktion. Diese Ergebnisse heben hervor, wie wichtig CLRs für die darmassoziierte Immunität sind, und demonstrieren zum ersten Mal eine immunregulatorische Rolle für SIGNR3 im Krankheitsverlauf der Colitis. Zusammenfassend sind die im Rahmen dieser Doktorarbeit produzierten und charakterisierten CLR-hFc Fusionsproteine sehr nützlich für die Identifikation von neuen Kohlenhydrat- Liganden oder von mikrobiellen Liganden. Die in vitro Stimulationsstudien sowie Immunisierungsstudien ergaben, dass einige Kohlenhydrat-Liganden immunmodulatorische Eigenschaften besitzen. Weiterhin wurde für SIGNR3 eine immunregulatorische Rolle in der Entstehung einer akuten Darmentzündung im Verlauf der murinen Colitis entdeckt. Insgesamt heben diese Ergebnisse die wichtige Rolle von CLRs und ihre Ligand-Erkennung in der angeborenen Immunität hervor.
