Role of Cytochrome P450 (CYP)-dependent Eicosanoids in experimental Acute Kidney Injury (AKI)

Abstract

Background and hypothesis: Ischemic acute kidney injury (AKI) greatly contributes to patients’ morbidity and mortality in various clinical settings. Searching for novel therapeutic strategies, the present work has been focused on the potential role of cytochrome P450 (CYP)-dependent eicosanoids in the development of AKI. These eicosanoids include 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) and epoxyeicosatrienoic acids (EETs) that play opposite roles in the regulation of vascular tone, inflammation, and apoptosis. The specific hypothesis was that pharmacological or genetic interventions enhancing EET actions may prevent the initiation of AKI. Experimental strategy and methods: First, the capacity of a synthetic EET analog to provide protection against renal ischemia/reperfusion (I/R)-injury was evaluated in rats. In a second approach, the effect of reducing endogenous EET degradation was analyzed by comparing renal I/R-injury in wild type (WT) and soluble epoxide hydrolase- knockout (sEH-KO) mice. Kidney damage was evaluated by functional and histomorphological parameters in male animals that underwent renal ischemia (45 min in rats, 22 min in mice) followed by two days of reperfusion. CYP- eicosanoids were analyzed by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Results: In rats, ischemia induced a massive release of 20-HETE in the kidney, whereas free EETs were not accumulated. Administration of the EET analog before ischemia compensated for the lack of endogenous EET release and significantly alleviated I/R-induced reduction of kidney function, tubular apoptosis, and inflammatory cell infiltration. In contrast to the initial expectations, renal function declined more severely in sEH-KO compared to WT mice as indicated by higher serum creatinine and urea levels. The sEH-KO mice also featured higher tubular lesion scores, increased tubular apoptosis and inflammation. Plasma and renal EET levels were higher in sEH-KO than WT mice. However, renal, but not plasma and hepatic, 20-HETE levels were significantly increased in sEH-KO compared to WT mice. In line with this finding, renal expression of Cyp4a12a, the murine 20-HETE-generating enzyme, was up-regulated both at the mRNA and protein levels, and Cyp4a12a immunostaining was more intense in the renal vessels of sEH-KO than WT mice. These results indicate that the potential beneficial effects of reducing EET degradation were obliterated by a thus far unknown mechanism leading to kidney- specific upregulation of 20-HETE formation in sEH-KO mice. Conclusions: The data obtained both in rats and mice suggest that imbalances in the formation of 20-HETE and EETs play a pivotal role in setting the stage for the cascade of events leading to renal I/R-injury. Pharmacological interventions with synthetic EET analogs could offer promising new options for AKI prevention.

Hintergrund und Hypothese: Ischämie-bedingtes akutes Nierenversagen (ANV) kann als schwerwiegende Komplikation in verschiedenen klinischen Situationen auftreten und führt zu erhöhter Morbidität und Mortalität der Patienten. Zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze wird in der vorliegenden Arbeit die Rolle von Cytochrom P450 (CYP)-abhängigen Eicosanoiden bei der Entstehung des ANV untersucht. Zu diesen Eicosanoiden gehören 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) und Epoxyeicosatriensäuren (EETs), welche als Gegenspieler bei der Regulation des Gefäßtonus, Inflammation und Apoptose fungieren. Mittels pharmakologischer und genetischer Interventionen wurde die Hypothese untersucht, ob durch Verstärkung der EET-Wirkung die Auswirkungen des akutem Nierenversagens abgemildert werden können. Experimentelles Design und Methoden: Zunächst wurde die Wirkung eines synthetischen EET-Analogons auf den renalen Ischämie/Reperfusions (I/R)-Schaden bei der Ratte untersucht. In einer zweiten Versuchsreihe wurden Wildtyp (WT)- und Knockout (KO)-Mäuse für das Enzym lösliche Epoxidhydrolase (sEH) (sEH-KO-Mäuse) eingesetzt, um die Effekte eines verminderten EET-Abbaus auf den Schweregrad des I/R-induzierten Nierenschadens zu analysieren. Das Ausmaß des Nierenschadens wurde anhand funktioneller und histomorphologischer Parameter bewertet, nach dem die Tiere einer renalen Ischämie (45 Minuten in Ratten, 22 Minuten in Mäusen) gefolgt von einer zweitägigen Beobachtungsphase nach Reperfusion unterworfen wurden. Die CYP-Eicosanoide wurden mittels Flüssigchromatographie Tandem- Massenspektrometrie bestimmt. Ergebnisse: In der Rattenniere kam es während der Ischämie zu einer gesteigerten Freisetzung von 20-HETE, während eine vermehrte EET-Bildung ausblieb. Die Gabe eines EET-Analogons vor Ischämie führte zu einer signifikanten Verminderung des I/R-induzierten renalen Funktionsverlusts, der tubulären Apoptose sowie der Infiltration von Entzündungszellen. Im Gegensatz zur Ausgangshypothese, zeigten sEH-KO Tiere einen größeren Nierenfunktionsverlust als WT-Tiere. Auch das Ausmaß des tubulären Schadens, sowie der tubulären Apoptose und der inflammtorischen Gewebsreaktion war in den sEH-KO Tieren signifikant stärker als in den Wildtypmäusen. Auf metabolischer Ebene führte der sEH-KO wie erwartetet zur Erhöhung der endogenen EET-Spiegel in allen untersuchten Geweben (Niere, Leber und Plasma). Zugleich wiesen die sEH-KO Tiere jedoch auch einen erhöhten 20 -HETE-Gehalt im Nierengewebe aber nicht in Plasma und Leber auf. Die erhöhten renalen 20-HETE-Spiegel korrelierten mit einer verstärkten mRNA und Protein Expression von Cyp4a12a, der murinen 20-HETE-Synthase, sowie einer erhöhten immunhistochemischesn Cyp4a12a-Expression in Nierengefäßen bei sEH-KO Mäusen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der potenziell schützende Effekt des verminderten EET-Abbaus durch eine Nieren-spezifische Steigerung der 20-HETE- Bildung in sEH-KO Mäusen aufgehoben wurde. Zusammenfassung: Die Ergebnisse aus beiden Tiermodellen zeigen, dass eine Imbalanz zwischen 20-HETE und EETs das Ausmaß des I/R-induzierten Nierenversagens entscheidend beeinflusst. Pharmakologische Interventionen mit synthetischen EET-Analoga könnten ein vielversprechender neuer Ansatz zur ANV-Prävention sein.