Nachweis und Charakterisierung von Antibiotika-resistenten ‎Staphylokokken mittels Multiplex-PCR und DNA-Microarray

Abstract

Staphylokokken-Infektionen werden meist durch Bakterien verursacht, die sich bereits auf ‎der Haut oder den Schleimhäuten ansiedeln. Die Ursache kann jedoch auch eine ‎Übertragung der Bakterien durch andere Menschen sein. Im Krankenhaus entstehen immer ‎wieder Infektionen, weil insbesondere der Stamm Staphylococcus aureus von Ärzten und ‎Pflegekräften unbemerkt auf den Patienten übertragen wird. Diese Bakterien gehören daher ‎auch zu den bekannten multiresistenten Krankenhauskeimen (MRSA) und auch zu ‎Pathogenen, die besonders häufig mit Infektionen in Krankenhäusern oder sogenannten ‎nosokomialen Infektionen assoziiert werden. ‎ Das Ziel dieser Dissertationsarbeit richtete sich zunächst auf die Differenzierung von MRSA ‎‎(Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus) und MSSA (Methicillin- sensitiver ‎Staphylococcus aureus) durch den Nachweis des mecA-Gens. Darüber hinaus wurden ‎Staphylococcus aureus von Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus haemolyticus ‎sowie weitere klinisch relevante Staphylokokken- Stämme mittels der 23S-rDNA- und 16S-‎rDNA-Gene unterschieden. Für diesen Zweck wurden 166 Staphylokokken-Stämme vom ‎Robert Koch Institut (RKI) durch eine Multiplex-Markierungs-PCR amplifiziert und ‎anschließend auf einem Microarray hybridisiert. Ein Microarray besteht grundsätzlich aus ‎den verschiedenen Oligonukleotiden–Sequenzen oder Sonden, welche auf einem ‎Objektträger aus Glas immobilisiert sind. Die Sonden dazu wurden so konzipiert, dass sie ‎mittels der Nicht-SNP- und SNP-Sonden, die Stämme und das Vorhandensein der Resistenz ‎detektieren können. Die Amplifikation der drei erwünschten Gene (23S-rDNA-, 16S-rDNA- ‎und mecA-Gen) konnte hier in einer Multiplex-Fluoreszenzmarkierungs-PCR für alle Stämme ‎nicht erzielt werden. Im Gegensatz dazu, konnte die Amplifikation aller Gene mit der ‎optimierten Multiplex-Screening-PCR erfolgreich erreicht werden. Insbesondere zeigte die ‎Amplifikation des 23S-rDNA-Gens mit 1840 bp in einer Multiplex- Markierungs-PCR bei ‎mehreren Stämmen immer wieder viele Hindernisse und Schwierigkeiten. Somit musste eine ‎zusätzliche Monoplex-Markierungs-PCR für das 23S-rDNA-Gen bei entsprechenden Stämmen ‎angeschlossen werden. Abschließend kann man sagen, dass im Rahmen dieser Arbeit S. ‎aureus von S. epidermidis, S. hominis und S. haemolyticus sowie von anderen Stämmen ‎zweifelsfrei mit Microarray identifiziert werden konnten. Des Weiteren konnte die Resistenz ‎durch das Vorhandensein vom mecA-Gen erfolgreich nachgewiesen werden. Es wurde auch ‎bestimmt, ob es sich um das mecA-Gen um SCCmec-Typ mecA-I_X oder mecA-XI handelt.‎

Staphylococcal infections are usually caused by bacteria that already settle on the human ‎skin or the mucous membranes. The cause can however also be a transfer of the bacteria by ‎other humans. In the hospital arise always different infections, because in particular the ‎Staphylococcus aureus strain of doctors and nurses is transferred without notice to the ‎patients. These bacteria therefore belong to the known multiresistant hospitals germs ‎‎(MRSA) and also to pathogens, which are particularly frequently associated with hospitals ‎infections or so-called nosocomial infections. ‎ The aim of this dissertation work was to differentiate MRSA (Methicillin-resistant ‎Staphylococcus aureus) and MSSA (Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus) by detecting ‎the mecA-gene. Furthermore, Staphylococcus aureus from Staphylococcus epidermidis and ‎Staphylococcus haemolyticus as well as other Staphylococcal strains were distinguished via ‎the 23S rDNA- and 16S rDNA- genes.‎ For this purpose, 166 staphylococcal strains from Robert Koch Institute (RKI) were amplified ‎by multiplex labeling PCR and then hybridized on a microarray. The microarray basically ‎consists of the different oligonucleotide sequences or probes, which are immobilized on a ‎glass slide. The probes were designed to detect the strains and the presence of resistance ‎with non SNP and SNP probes. Amplification of the three desired genes (23S- rDNA, 16S-rDNA ‎and mecA gene) could not be achieved in a multiplex fluorescence labeling PCR for all ‎strains. In contrast, the amplification of all genes was successfully achieved with the ‎optimized multiplex screening PCR. In particular, the amplification of the 23S-rDNA gene ‎with 1840 bp in multiplex labeling PCR showed several obstacles and difficulties in several ‎strains. Thus, an additional monoplex labeling PCR for the 23S rDNA gene had to be ‎performed in these strains. Finally, it can be said that within the scope of this study S. aureus ‎from S. epidermidis, S. hominis and S. haemolyticus as well as other strains could be ‎identified with use of the Microarray. Furthermore, was able to demonstrate the resistance ‎successfully by proving the presence of the ‎mecA gene. It was also determined whether the ‎mecA gene is SCCmec type mecA-I_X or mecA-XI.‎