Einleitung: Moraxella catarrhalis ist ein COPD-assoziierter Erreger, der durch eine chronische Kolonisation der unteren Atemwege vermutlich die persistierende Inflammation der COPD mit aufrechterhält und durch akute Infektionen mit einem für den Wirt neuen M. catarrhalis-Stamm für ca. 15 % der bakteriell induzierten Exazerbationen der COPD verantwortlich ist. Hinsichtlich der weltweit steigenden Zunahme Antibiotika-resistenter M. catarrhalis-Stämme kommt der Erforschung endogener humaner antimikrobieller Peptide (AMP) als mögliche alternative und innovative Antibiotika, von denen auch COPD-Patienten profitieren könnten, eine besondere Bedeutung zu. Die AMP sind evolutionär sehr ursprüngliche und wichtige Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems, die neben ihrer antimikrobiellen Wirkung auch immunmodulatorische Funktionen ausüben. Das humane β-Defensin-3 (hBD-3) gehört zu den AMP des Menschen, welches unter den humanen β-Defensinen die stärkste antimikrobielle Aktivität gegen ein sehr breites Erregerspektrum besitzt und nach inflammatorischer oder infektiöser Stimulation u. a. von den Epithelzellen der Atemwege und Lunge freigesetzt wird. Bislang ist die antimikrobielle Aktivität von hBD-3 gegenüber M. catarrhalis sowie die Regulation der hBD-3-Expression im Hinblick auf eine Infektion des respiratorischen Epithels mit M. catarrhalis nicht bekannt und wurden daher in der vorliegenden Arbeit im Detail untersucht. Methodik: In einem AMP- Empfindlichkeitstest mit rekombinantem hBD-3 (rhBD-3) und Koloniezählverfahren wurde die antimikrobielle Wirksamkeit von hBD-3 gegenüber M. catarrhalis- Wildtypstämmen (O35E, ATCC 25238) untersucht. Nach Infektion von humanen primären Bronchialepithelzellen (PBEC), humaner Bronchialepithelzellline (BEAS-2B) und humaner Typ II-Alveolarepithelzellline (A549) mit M. catarrhalis-Wildtypstämmen (O35E, ATCC 25238, O46E) oder M. catarrhalis- Mutantenstämmen (O35E.1, O35E.2, O35E.lpxA) wurde die hBD-3-Expression per RT- PCR und ELISA analysiert. In siRNA-Transfektionsversuchen (siTLR2, siTLR4) erfolgte die Bestimmung der TLR-vermittelten hBD-3-Expression nach Stimulation mit M. catarrhalis oder M. catarrhalis-spezifischem LOS. Der Einsatz von Inhibitoren (SB202190, U0126, SP600125, IKK-NBD), Western Blot- und ChIP- Analysen ermöglichten die Bestimmung der an der hBD-3-Expression nach M. catarrhalis-Infektion beteiligten MAPKs und Transkriptionsfaktoren. Ergebnisse: Die Inkubation von M. catarrhalis mit rhBD-3 zeigte einen starken antimikrobiellen Effekt des Peptids auf diesen Erreger. Des Weiteren induzierte die Infektion von respiratorischen Epithelzellen mit M. catarrhalis eine gesteigerte Transkription und Sekretion von hBD-3. Diese M. catarrhalis- induzierte hBD-3-Expression war abhängig vom hitzestabilen M. catarrhalis- Virulenzfaktor LOS, während die M. catarrhalis-Oberflächenproteine UspA1 und UspA2 keine Rolle für die hBD-3-Produktion spielten. Der transiente Knockdown der TLR2-Expression führte zu einer erniedrigten hBD-3-Sekretion nach Stimulation mit M. catarrhalis bzw. M. catarrhalis-LOS, wohingegen der transiente Knockdown der TLR4-Expression keinen Einfluss auf die hBD-3-Expression hatte. Zudem führte die Inhibition der MAPKs ERK1/2 und JNK, aber nicht von p38 MAPK, zu einer verringerten hBD-3-Bildung nach M. catarrhalis-Infektion. Die M. catarrhalis-induzierte hBD-3-Produktion wurde über die Rekrutierung der AP-1-Transkriptionsfaktoruntereinheit c-Jun an den hBD-3-Genpromotor vermittelt und war unabhängig von NF-κB. Schlussfolgerung: Zusammenfassend wurde gezeigt, dass das respiratorische Epithel nach Infektion mit M. catarrhalis in Abhängigkeit von dessen Virulenzfaktor LOS über einen TLR2-MAPKs ERK1/2 und JNK sowie Transkriptionsfaktor c-Jun/AP-1-vermittelten Signalweg das hBD-3 produziert, welches seinerseits gegenüber M. catarrhalis äußerst bakterizid wirkt.
Introduction: Moraxella catarrhalis is a COPD-associated pathogen, which maintains probably additively through chronic colonisation of the lower airways the persistent inflammation in COPD and is responsible for nearly 15 % of the bacterial induced exacerbations of COPD through an acute infection with one for the host new M. catarrhalis strain. Because of the worldwide increase of antibiotic-resistant M. catarrhalis strains the research for endogenous human antimicrobial peptides (AMPs) as potential alternative and innovative antibiotics, which could also be a benefit to COPD-patients, becomes a particular importance. AMPs are evolutionary very original and important effector molecules of the innate immunity, which have next to their antimicrobial properties also several immunomodulatory functions. Human β-defensin-3 (hBD-3) belongs to one of the human AMPs, that has the strongest antimicrobial activity against a broad range of pathogens compared to all human β-defensins and is secreted inter alia by airway and lung epithelial cells under inflammatory and infectious conditions. Until now the antimicrobial effect of hBD-3 against M. catarrhalis and the regulation of the hBD-3 expression with regard to an infection of the respiratory epithelium with M. catarrhalis were unknown and was therefore the object for investigation in this present work. Methods: The antimicrobial potential against the M. catarrhalis wildtype-strains (O35E, ATCC 25238) was examined by an antimicrobial peptide resistance assay with recombinant hBD-3 (rhBD-3) and colony count assay. After infection of human primary bronchial epithelial cells (PBEC), human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) and human type II alveolar epithelial cell line (A549) with M. catarrhalis wildtype-strains (O35E, ATCC 25238, O46E) or M. catarrhalis mutants (O35E.1, O35E.2, O35E.lpxA) the hBD-3 expression was analyzed via RT-PCR and ELISA. The determination of TLR-mediated hBD-3 expression after stimulation with M. catarrhalis or M. catarrhalis specific LOS was identified through siRNA transfection studies (siTLR2, siTLR4). The use of inhibitors (SB202190, U0126, SP600125, IKK-NBD), Western Blot and ChIP analysis enabled the investigation of MAPKs and transcription factors involved in hBD-3 expression after M. catarrhalis infection. Results: Incubation of M. catarrhalis with rhBD-3 showed a strong antimicrobial effect of the peptide towards this pathogen. Furthermore, infection of respiratory epithelial cells with M. catarrhalis induced an increased transcription and secretion of hBD-3. This M. catarrhalis-induced hBD-3 expression was dependent on heat-stable M. catarrhalis-virulence factor LOS, while the M. catarrhalis outer membrane proteins UspA1 and UspA2 were not important for the hBD-3 production. The transient knockdown of TLR2 expression led to a decreased hBD-3 release after stimulation with M. catarrhalis or M. catarrhalis-specific LOS, whereas the transient knockdown of TLR4 expression had no influence on the hBD-3 expression. In addition, the inhibition of MAPKs ERK1/2 and JNK, but not of p38 MAPK, attenuated the hBD-3 secretion after M. catarrhalis infection. M. catarrhalis-induced hBD-3 production was mediated via recruitment of AP-1 transcription factor subunit c-Jun to the hBD-3 gene promoter and was independent of NF-κB. Conclusion: In conclusion, findings of the present study demonstrated, that the respiratory epithelium produces after infection with M. catarrhalis in dependence on its virulence factor LOS via a TLR2-MAPKs ERK1/2 and JNK as well as transcription factor c-Jun/AP-1 mediated pathway the hBD-3 peptide, which acts potently bactericidal against M. catarrhalis.
