As presented in my thesis, we made enormous progress in resolving the molecular details of the photoreaction of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 (ChR2), by applying time-resolved molecular spectroscopy. I have shown that D253 is the primary proton acceptor and D156 the internal proton donor of the retinal Schiff base of ChR2. The reprotonation of the latter residue constitutes the molecular determinant for channel closure. Upon H/D exchange of the solvent, the kinetic and vibrational isotope effects of these reactions and that of E90, a key residue in ion selectivity, were determined. My experiments with a pH indicating dye show that the de- and reprotonation of E90 takes place during the life time of the desensitized P4 state. Thus, other conclusions that E90 plays a key role in channel opening are clearly ruled out. Light-adapted ChR2 contains a mixture of all-trans and 13-cis retinal. I contributed to time-resolved analysis of the E123T variant and we could show that the 13-cis photocycle does not lead to channel opening. Furthermore, the channel opening tallies with transient changes in the amide I vibration, identified as water influx to hydrate the peptide backbone. These findings from ChR2 were confirmed by ex- pediments on variants of ChR2 that exhibit accelerated (E123T) or delayed (D156E) channel opening. The associated activation volumes are monitored and quantified by flash photolysis under hydrostatic pressures. Finally, the loss-of-function variant R120H was investigated, which exhibits wild-type photocycle kinetics but channel activity is blocked. Time-resolved IR spectroscopy covering almost 13 decades in time are presented (from 500 fs to s). An assignment of the arginine band was not feasible, but the possible role of His-Arg interactions were discussed and I demonstrated that R120 is not part of the proton release complex. Although the mechanistic link between proton transfer reactions and channel func- tion remain elusive, I could show that protonation dynamics are crucial in the ChR2 photocylce and are related to ion conductance. ChR2 is the mayor tool in optoge- netics and a detailed understanding of this ion channel is supportive for medical application. Furthermore, it is a good model system for other ion channels, because in ChR2 ion permeation is triggered repeatable, non-invasive and reproducible by light, which allows the observation of channel on- and off-gating with high temporal and spacial resolution.
In meiner Dissertation präsentiere ich unsere Fortschritte bei der molekularen Erforschung des lichtgesteuerten Innenkanals Kanalrhodopsin-2 (ChR2) mittels zeitaufgelöster Spektroskopie. Ich konnte zeigen, dass D253 der primäre Protonenakzeptor und D156 der primäre Protonendonor der Schiffschen Base in ChR2 ist. Die Reprotonierung von D156 geht einher mit der Kanalschließung. Durch Messungen in H2O und D2O konnten der kinetische und spektrale Isotopeneffekt dieser Reaktionen und von E90 bestimmt werden. E90 is wichtig für die Ionenselektivität, aber eine De- und Resprotonierungsdynamik wurde nur im späten P4 Intermediat beobachtet. Damit konnten andere Schlussfolgerungen, dass E90 eine wichtige Rolle bei der Kanalöffnung hat, widerlegt werden. Im lichtadaptierten Zustand von ChR2 liegt das Retinal in der all-trans und 13-cis Konfiguration vor. Wir konnten anhand der E123T Variante zeigen, dass der 13-cis Photozyklus nicht zu einer Kanalöffnung führen kann. Die Öffnung des Ionenkanals folgt Schwingungsänderungen in der Amid I region, welche als Einströmen von Wassermolekülen identifiziert wurde, welche die Helices hydratisieren. Diese Korre- lation wurde mit Hilfe von Varianten bestätigt, welche eine beschleunigte (E123T) bzw. langsamere (D156E) Kanalaktivität zeigen. Die erwarteten Aktivierungsvol- umen wurden durch Blitzlichtspektroskopie bei verschiedenen Drücken ermittelt. Die Variante R120H hat keine Kanalaktivität mehr, jedoch einen unveränderten Photozyklus. Zeitaufgelöste Absorptionsänderungen über fast 13 Dekaden (von 500 fs bis s) wurden dargestellt. Die Zuordnung der Argininbande war nicht eindeutig, jedoch wurden His-Arg Interaktionen im Detail erörtert und ich konnte zeigen, dass R120H nicht Teil der Protonenabgabegruppe ist. Obwohl die genaue Verbindung zwischen Protonierungsänderungen und Kanal- funktion nicht vollständig geklärt wird, konnten wir zeigen, dass Protonierungs- dynamiken eine entscheidende Rolle in ChR2 haben. Es ist das am häufigsten verwendete optogenetische Werkzeug und detaillierte Erkenntnisse über dieses Pro- tein werden die medizinische Anwendungsmöglichkeiten verbessern. Außerdem ist ChR2 ein gutes Modellsystem für andere Ionenkanäle, da die Kanalöffnung nicht invasiv und reproduzierbar durch Licht aktiviert werden kann. Dies ermöglicht die Untersuchung der Kanalaktivität mit hoher zeitlicher und spektraler Auflösung.
