In dieser Arbeit wurde die aktive Na+-Resorption unter Beteiligung des epithelialen Na+-Kanals (ENaC) in gesundem und Colitis ulcerosa-Gewebe untersucht, die den Hauptmechanismus der Natriumresorption im distalen Colon darstellt. Die Regulation des ENaC in Colitis ulcerosa-Präparaten wurde anhand von elektrophysiologischen, immunhistochemischen und molekularbiologischen Methoden charakterisiert. Ebenso wurden die Auswirkungen von pro- inflammatorischen Zytokinen auf die Regulation des ENaC untersucht. Zunächst wurde Colongewebe aus Operationspräparaten von Kontroll- und Colitispatienten gewonnen und nach Präparation in die Ussingkammer zur Messung des Kurzschlussstroms eingespannt. Nach 8 Stunden Inkubation mit Aldosteron wurde der elektrogene Natrium-Transport bestimmt und durch Hemmung mit Amilorid quantifiziert. Im gesunden Colongewebe stieg der Natrium-Transport unter Aldosteron deutlich an, während in Colitis ulcerosa-Präparaten ein gestörter Natriumstrom registriert wurde. In Northern-Blots wurde dann die Gesamt-RNA aus den Gewebsstücken isoliert und die mRNA-Expression der alpha-, beta- und gamma-Untereinheiten des ENaC unter Aldosteron-Einfluss untersucht. In Kontrollgewebe zeigte sich eine deutliche Induktion der beta- und gamma- Untereinheiten, in Colitis ulcerosa-Präparaten blieb dieser Effekt aus. Die alpha-Untereinheit war in Colitis ulcerosa-Präparaten nicht signifikant zur Kontrolle verändert. Auf Proteinebene konnten ähnliche Phänomene gesehen werden. In Western-Blots zeigte sich das gleiche Muster wie auf mRNA-Ebene: die Expression der alpha-Untereinheit blieb unverändert unter Aldosteron- Inkubation, die beta- und gamma-Untereinheiten wurden in Kontrollgewebe deutlich stärker exprimiert. In Colitis ulcerosa-Präparaten blieb die Antwort der beta- und gamma-Untereinheiten auf Aldosteron aus. Die alpha-Untereinheit blieb in der Mucosa enthalten, was einen Hinweis für die Reifung des Epithels lieferte. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe eines Korrekturfaktors, welcher den Unterschied von epithelialem und subepithelialem Widerstand der Gewebe berücksichtigte, korrigiert.In Immunfluoreszenzfärbungen zeigte sich, dass die beta- und gamma-Untereinheiten in den Kontrollgeweben stark durch Aldosteron induzierbar waren, während dies in Colitis-Präparaten nicht der Fall war. Die alpha-Untereinheit hingegen blieb exprimiert, auch in entzündetem Colitis- Gewebe. Die Expression der ENaC-Untereinheiten wurde in Experimenten mit pro- inflammatorischen Zytokinen betrachtet. Hierzu wurde humanes Colon sigmoideum zunächst mit den Zytokinen prä-inkubiert und nach Aldosterongabe der elektrogene Natrium-Transport bestimmt und die mRNA-Expression der drei ENaC- Untereinheiten untersucht wurde. Hierbei fand sich ein um ca. 50 % verminderter elektrogener Natrium-Transport in zuvor mit einer hohen Konzentration von TNF-alphaund IFN-gamma prä-inkubierten Geweben. Diese verminderte Stromantwort spiegelte sich auch in der verminderten mRNA- Expression der beta- und gamma-Untereinheit wieder. Somit basiert die Störung des elektrogenen Na+ -Transports auf einer durch Zytokine hervorgerufenen spezifischen Hemmung der mRNA-Expression der beta- und gamma-Untereinheit. Da die Zytokine TNF-alpha und IFN-gamma bei Colitis ulcerosa erhöht gefunden werden, liegt der gestörten Na+-Resorption bei Colitis ulcerosa mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Zytokin-bedingte Hemmung der Transporterexpression zugrunde.
The main limiting factor for sodium absorption in distal colon is the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). In this study mechanisms involved in the dysregulation of EnaC expression in ulcerative colitis were characterized (UC). Epithelial preparations from surgically removed inflamed and control sigmoid colons were used. Active electrogenic Na+ transport (JNa) was determined after 8-hour aldosterone stimulation in Ussing-chambers and corrected for the altered epithelial/subepithelial resistance ratio. ENaC alpha-, beta- and gamma-subunits were analyzed immunohistochemically and in Western and Northern blots (corrected for the inflammatory increase in subepithelial protein content). Also, the effects of proinflammatory cytokines on sodium transport and ENaC transkription were analyzed. In controls, aldosterone stimulated JNa and induced ENaC beta- and gamma-subunit expression, whereas this response was virtually abolished in UC. Preservation of surface epithelium in UC was indicated by unchanged ENaC alpha-subunit expression, which points also against a mere immaturity or epithelial cell loss. Inhibition of electrogenic sodium transport as well as beta- and gamma- ENaC mRNA expression could be mimicked in control colon by in vitro preexposure for 8 hours to tumor necrosis factor alpha and interferon gamma. It can be concluded that, in ulcerative colitis, elevated proinflammatory cytokines selectively impair beta- and gamma-ENaC expression, which contributes to diarrhea by reducing colonic sodium absorption.
