In this thesis, the electrostatic interactions governing the energetics of electron transfer (ET) processes in two types of proteins with redox-active cofactors were investigated theoretically. For this purpose a combination of density functional and electrostatic theories were applied to elucidate the function of redox-active proteins. Our attention was focused to calculate the energetics of protonation and oxidation processes in these proteins. The results of the theoretical work presented here, are divided into three mutually related parts. To compute cofactor redox potentials in proteins by electrostatic energy evaluation one needs the redox potential of a corresponding faithful model compound in solution. In case of iron-sulfur compounds such information is generally not available. Hence, there is need for quantum chemical computations of redox potential values of model compounds. Therefore, I started with the computation of ''absolute'' redox potentials of iron-sulfur model compounds whose experimental measurements are not available. The redox potential values of these model compounds in aqueous solution are necessary as a reference value to compute their redox potential in protein using the difference in solvation energy of the model compound in water and in protein. In the case of iron-sulfur complexes (ISC), there are no appropriate model compounds available in solution that corresponds to the cofactor in protein. These model compounds are negatively charged and difficult to stabilize in aqueous solution. The redox potentials for a series of mono-metallic ISC was computed and their energetics in different dielectric media was compare to elucidate the different effects that shift their redox potentials inside the protein. We found that there are three main factors influencing the redox potentials of the ISC in the protein: the conformation adopted inside the protein (that may differ from the more energetically favorable in isolation), the number and type of hydrogen bonds towards the ISC and the dielectric environment provided by the ISC surrounding amino acids and the solvation accessibility. In the second part of the project I wanted to compute the ISC redox potential in rubredoxin (Rd). We used the continuum electrostatic approach where the protein is represented as dielectric continuum with low dielectric constant and individual atomic partial charges, while the solvent is represented with a high dielectric constant without individual charges. The protonation and oxidation probabilities of titratable groups and the cofactor were computed simultaneously by solving the linearized Poisson-Boltzmann equation numerically on a grid with a subsequent Monte Carlo titration of all titratable groups in the protein. The electrostatic energies were computed using a number of specially prepared protein conformers, which were optimized self-consistently for different pHs and solvent redox potentials with a new algorithm (Karlsberg+) that considers different crystal structures and multiple side chain conformers. The close correlation of our computed ISC redox potentials with experimental results allows quantifying the influence of the different factors on the ISC redox potentials in Rubredoxin. One important factor is for instance, the change of conformation of some amino acid side chains upon reduction of the ISC. Finally, we present results on redox potential computations of 31 artificial cytochrome b (aCb) mutants including one redox-active heme. Since no crystal structures were available for these aCbs, the coordinates were generated from scratch by a modeling procedure. The agreement between calculated and measured redox potentials allows excluding one of two possible conformations, which the heme can adopt. Accordingly, the heme propionates are pointing to the close end of the four- helix bundle rather than to the open end. Molecular dynamics results demonstrate that the modeled aCb structures remain stable during a long term computer simulation, thus validating the modeled structures. Analysis of the dependence of heme redox potential on protein environment shows that the shifts in redox potentials relative to the model systems in water are due to the low-dielectric medium of the protein and the protonation states of the heme propionates. In this work new methods have been introduced, combining and improving currently used methods that can provide further and deeper insightsin the relationship between structure and function of redox-active proteins. Theoretical investigations presented here, can help to better understand experimental results on redox-active proteins. Many of our results are based on informations from crystal structures. However, introducing special ISC model compounds and modeling aCb structures to investigate their redox behavior, can help to gain deeper understanding of how nature controls cofactor redox potentials in proteins.
In dieser Arbeit wird der Einfluss elektrostatischer Wechselwirkungen auf die Energetik von Elektronentransferprozessen in zwei Proteinen mit sehr verschiedenen redoxaktiven Kofaktoren theoretisch untersucht. Dazu wurde eine Dichtefunktional Theorie (DFT) mit speziellem Funktional mit elektrostatischer Energieberechnung kombiniert, um die Funktion einiger redoxaktiver Proteine aufzuklären. Das Hauptaugenmerk war dabei auf die Berechnung der Energetik von Protonierungs- und Oxidationsprozessen in diesen Proteinen gerichtet. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse sind in drei miteinander in Zusammenhang stehenden Teilen dargestellt. Um Redoxpotentiale von Kofaktoren in Proteinen mit Hilfe von elektrostatischen Energien zu berechnen, wird das Redoxpotential entsprechender Modellverbindungen benötigt. Im Fall von Eisen- Schwefel-Verbindungen gibt es keine Daten zu realistischen Modelverbindungen. Aus diesem Grund ist es notwendig die Redoxpotentiale dieser Verbindungen mit quantenchemischen Methoden zu berechnen. Deshalb habe ich zunächst "absolute" Redoxpotentiale von Modellverbindungen berechnet, für die keine experimentellen Werte existieren. Die Redoxpotentiale dieser Modellverbindungen in wässriger Lösung werden als Bezugswerte benötigt, um zusammen mit der Differenz der Solvatationsenergien der Modellverbindung in Wasser und im Protein das Redoxpotential im Protein zu berechnen. Im Fall von Eisen-Schwefel-Komplexen (ISC) gibt es keine passenden Modellverbindungen in Lösung, die den Kofaktoren im Protein entsprechen. Die vorhandenen Modellverbindungen dieser Art sind sehr stark negativ geladen und es ist deshalb schwierig sie in wässriger Lösung zu stabilisieren. Die Redoxpotentiale einer Anzahl von Eisen-Schwefel-Komplexen wurden berechnet und ihre Energien in unterschiedlichen Dielektrika wurden verglichen, um die verschiedenen Effekte, die zur Veränderung ihrer Redoxpotentiale im Protein beitragen, zu erklären. Wir fanden heraus, dass es drei Hauptfaktoren gibt, welche die Redoxpotentiale dieser Kofaktoren in Proteinen beeinflussen: Die Konformation, die im Protein angenommen wird (welche von der im isolierten Zustand energetisch bevorzugten abweicht), die Anzahl und Art von Wasserstoffbindungen mit dem Kofaktor und die dielektrische Umgebung des Kofaktors, sowie auch der Kontakt mit dem Lösungsmittel. Im zweiten Teil des Projekts, wurden die Redoxpotentiale der Eisen-Schwefel-Komplexe in Rubredoxin (Rd) berechnet. Wir verwendeten einen elektrostatischen Ansatz, in dem das Protein durch ein elektrostatisches Kontinuum mit niedriger Dielektrizitätskonstante und den Partialladungen der einzelnen Atome repräsentiert wird, während das Lösungsmittel durch eine hohe Dielektrizitätskonstante und ohne Partialladungen dargestellt wird. Die Wahrscheinlichkeiten für Protonierung und Oxidation der titrierbaren Gruppen und des Kofaktors wurden durch Lösen der linearisierten Poisson-Boltzmann- Gleichung auf einem räumlichen Gitter berechnet. Anschließend wurde die Titration dieser Gruppen mittels einer Monte-Carlo-Methode durchgeführt. Die elektrostatischen Energien wurden unter Verwendung einer Anzahl speziell präparierter Proteinkonformationen berechnet. Diese wurden mit Hilfe eines neuen Algorithmus (Karlsberg+) selbstkonsistent für verschiedene pH Werte und Redoxpotentiale des Lösungsmittels unter Berücksichtigung verschiedener Kristallstrukturen und multiplen Seitenkettenkonformeren optimiert. Die enge Korrelation der von uns berechneten Redoxpotentiale mit experimentellen Werten erlaubt es den Einfluss verschiedener Faktoren auf den genauen Wert des Redoxpotentials der Eisen-Schwefel-Komplexe in Rubredoxin zu quantifizieren. Beispielsweise ist die Änderung der Konformation der Seitenketten einiger Aminosäuren bei der Reduktion des ISC ein wichtiger Faktor. Schließlich zeigen wir die Ergebnisse der Berechnung der Redoxpotentiale von 31 künstlichen Cytochrom-b (Cb) Mutanten mit einem redoxaktiven Häm. Da für diese künstlichen Cbs keine Kristallstrukturen vorliegen wurden die Atomkoordinaten mittels einer Modellierungsmethode erzeugt. Die übereinstimmung zwischen berechneten und gemessenen Redoxpotentialen erlaubt es eine der beiden möglichen Hämkonformationen auszuschließen. Dementsprechend sind die Hämpropionate zum geschlossenen Ende des Vier-Helix-Bündels ausgerichtet. Molekulardynamiksimulationen zeigen die Stabilität der modellierten künstlichen Cb-Strukturen und validieren somit das Modellierungsverfahren. Eine Analyse der Abhängigkeiten des Hämredoxpotentials zeigt, dass die Verschiebung des Redoxpotentials gegenüber dem Modellsystem im Wasser durch die niedrige Dielektrizitätskonstante im Protein und die Protonierungszustände der Hämpropionate erklärt wird. In dieser Arbeit wurden neue Methoden eingeführt, die gegenwärtige Methoden kombinieren und verbessern, welche uns weitergehende und tiefere Einsichten in die Beziehung zwischen Struktur und Funktion von redoxaktiven Proteinen geben können. Die vorgestellten theoretischen Untersuchungen können zu einem besseren Verständnis experimenteller Ergebnisse von redoxaktiven Proteinen beitragen. Viele unserer Ergebnisse basieren auf Informationen aus Kristallstrukturen. Das Einführen von speziellen Eisen-Schwefel-Modellkomplexen und die Modellierung künstlicher Cbs zur Untersuchung von deren Redoxeigenschaften, kann helfen, die von der Natur eingesetzten Mechanismen zur Kontrolle der Redoxpotentiale von Kofaktoren in Proteinen besser zu verstehen.
