Identifikation und Charakterisierung von Medium Chain Acyl-CoA Dehydrogenase und Myosin Light Chain 4 als neuartige Interaktionspartner des Östrogenrezeptor alpha

Abstract

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die Hauptursache für Morbidität und Mortalität in der westli-chen Welt. Klinische Daten weisen geschlechtsabhängige Unterschiede bei Erkrankungen des Herzens aus, wobei Frauen eine zeitlich verzögerte Entwicklung und eine Konservierung der kardialen Pumpfunktion zeigen. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten, dass Östrogen durch Vermittlung von ERα in der Pathogenese von Herzerkrankungen eine Rolle spielt. In dieser Arbeit konnten MCAD und MYL4 als neue Interaktionspartner des ERα im humanen Herzen identifiziert werden. Die östrogenabhängige Interaktion zwischen ERα und MCAD konnte mittels „Yeast-Two- Hybrid“ nachgewiesen werden Die Interaktion war von der Anwesenheit eines vollständigen ERα abhängig. Ergebnisse der CoIP zeigten diese Interaktion ebenso im humanen Myokard. MCAD ist als schrittgebendes Enzym des Fettsäurestoffwechsels vor allem im Herzen von ent-scheidender Bedeutung für die Energieversorgung und wird im erkrankten Myokard auf mRNA- und Proteinebene reguliert. Die Interaktion mit ERα könnte durch Stabilisierung von MCAD im erkrankten Myokard den Erhalt der Energieversorgung des Herzens und somit der Integrität der kardialen Funktion gewährleisten. Die Co- Lokalisation von ERα und MCAD wurde im Zytop-lasma von AC16 Zellen gezeigt. Unsere Daten identifizierten die zytoplasmatischen Komparti-mente, in denen ERα und MCAD interagieren, als Mitochondrien. Die Expression von ERα in Mitochondrien einer humanen Kardiomyozytenzelllinie konnte in diesem Zusammenhang ers-tmalig gezeigt werden. MYL4 als Teil des Myosin Motorproteins, dessen Expression einen ausgeprägten Einfluss auf die kontraktilen Eigenschaften des Myokards hat, konnte als Interaktionspartner des ERα mittels „Yeast-Two-Hybrid“ bestätigt werden. Die Interaktion mit ERα konnte zudem im menschlichen Myokard nachgewiesen werden. Co- Lokalisationsexperimente konnten die Interaktion innerhalb der H-Banden der Sarkomere der Kardiomyozyten lokalisieren. Verstärkte Signale für MYL4 im Nukleus von AC16 Zellen nach Östrogenstimulation ergaben Hinweise auf eine Expressionsre-gulation der MYL4. Die Identifikation der involvierten Domänen beider Interaktionspartner wie-sen für den ERα die C-terminale EF Region als entscheidenden Bereich aus, der isoliert zu einer Interaktion mit der atrialen MYL4 befähigt war. Für MYL4 wiesen die Daten den N-terminalen Bereich des Proteins, der für die kontraktilitätsmodulierenden Eigenschaften der MYL4 verant-wortlich ist, als Ort der Interaktion aus. Diese Interaktion könnte einen Mechanismus auf mole-kularer Ebene darstellen, über welchen Östrogen zu einer Kompensation der funktionellen Ein-schränkung des hypertrophierten Myokards beiträgt. Mit vorliegender Arbeit wurden durch die Untersuchung neuer Interaktionspartner des ERα im humanen Myokard neue Erkenntnisse zu herzspezifischen Hormonwirkungen erzielt, aus welchen sich in Zukunft neue therapeutische Ansätze für Herz-Kreislauf-Erkrankungen ableiten lassen.

Estrogens (E2) are key regulators of growth, differentiation and physiological processes in various target tissues, including the human heart. E2 exerts its effects mainly through its cognate receptors, e.g.estrogen receptor (ER) α. ERα acts in concert with other interaction partners to mediate estrogenic effects. So far, only few interaction partners of ERα are known in the human myocardium. This project identified Medium Chain Acyl-CoA Dehydrogenase (MCAD) and atrial Myosin Light Chain 4 (MYL4) as novel interaction partners of ERα in the human myocardium. MCAD is catalyzing the initial step of mitochondrial ß-fatty acid oxidation and therefore takes an important role in the energy supply of the heart. It is known that in the diseased heart, the MCAD expression is down regulated due to switching myocardial energy substrate from fatty acids to glucose. MYL4, as part of the contractile apparatus, is expressed in the fetal heart and in the adult heart becomes restricted to the atria under physiological conditions. It is re-expressed in the adult hypertrophic ventricle and this switch is accompanied by alteration of contractile performance, thus improving global heart function. Yeast-Two- Hybrid (YTH) retransformation experiments showed the estrogen dependent interaction of ERα with MCAD and MYL4, respectively. Our data show the N-terminal region of MYL4 protein as location of the interaction with ERα, the area of the protein which is responsible for modulating contractile properties. Results of the co-immunoprecipitation (IP) confirmed the interaction of ERa with MCAD and MYL4 in the human myocardium. By immunofluorescence we could show the co-localisation of ERα and MCAD in the Mitochondria of AC16 cells. Co-localization experiments could localize the interaction of ERα and MYL4 within the sarcomeres of cardiomyocytes. Amplified signals for MYL4 in the nucleus of AC16 cells after estrogen stimulation indicated a regulation of expression of MYL4. With present work new knowledge about hormone effects specific for heart was achieved by investigating new interaction partners of ERα in the human myocardium which in future times could lead to new therapeutic attempts for cardiovascular diseases.